柴胡對對乙酰氨基酚及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)影響

吳殷囡，汪玉馨，杜益，楊方秀，宗衛(wèi)峰，孟長虹，譚力，陸益紅*（.徐州醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 徐州 004；.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 009；.浙江省中醫(yī)院藥劑科，杭州 0006）

對乙酰氨基酚（APAP）的過量使用易致嚴(yán)重的肝損傷甚至死亡，因此APAP 及其代謝產(chǎn)物的研究和監(jiān)測對于肝損傷風(fēng)險(xiǎn)的防范尤為重要。近年來，國內(nèi)外研究者對于APAP 的體內(nèi)過程及其毒性產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化過程等方面研究較為充分。正常劑量下，APAP 進(jìn)入體內(nèi)后經(jīng)CYP450 酶代謝生成活性中間體N-乙酰-對-苯醌亞胺（NAPQI），其在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的作用下生成谷胱甘肽結(jié)合物而排出體外。但當(dāng)過量服用APAP 時(shí)，因NAPQI 在體內(nèi)大量產(chǎn)生而耗竭谷胱甘肽（GSH），過量的NAPQI 則會結(jié)合肝細(xì)胞蛋白從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[1-5]。

在中藥配伍減毒增效的研究中發(fā)現(xiàn)，藥物聯(lián)用產(chǎn)生的減毒作用主要表現(xiàn)在對藥物體內(nèi)過程的影響，通過影響藥物及其毒性產(chǎn)物的體內(nèi)過程（包括吸收、代謝及排泄等），從而影響藥物的毒性[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柴胡及其制劑正柴胡飲對APAP 所致的肝損傷有預(yù)保護(hù)作用，從藥動(dòng)學(xué)角度來看，推測柴胡預(yù)保護(hù)作用的發(fā)揮可能與降低APAP 的入血濃度或減少APAP 毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物NAPQI 的產(chǎn)生有關(guān)[7]。

因此，本實(shí)驗(yàn)以APAP 及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物為研究對象，建立HPLC-MS/MS 檢測法，通過柴胡水提液預(yù)給藥后給予APAP，考察柴胡水提液對APAP 代謝物轉(zhuǎn)化的影響，以期為APAP 及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物的測定及后續(xù)機(jī)制研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀-三重四極桿質(zhì)譜儀，包括Finnigan TSQ Quantum Discovery Max 系統(tǒng)Xcalibur 1.2 數(shù)據(jù)采集軟件和LCQuan 數(shù)據(jù)處理軟件（美國Thermo 公司）；XP6 型/XS205DU 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；ZH-2 型自動(dòng)渦旋混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；真空離心濃縮揮干儀（美國Thermo 公司）；L-550 臺式低速離心機(jī)（湖南湘潭離心機(jī)有限公司）；Beckman Coulter Allegra 64R 臺式高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）；超純水機(jī)（美國Millipore 公司）。

1.2 試藥

對乙酰氨基酚[APAP，純度≥ 99%，批號：G1816129，阿拉丁試劑（上海）有限公司]；對乙酰氨基酚葡萄糖醛酸鈉鹽（APG，純度≥99%，批號：3-NAV-128-3）、對乙酰胺氨基酚半胱氨酸三氟乙酸鹽（APC，純度≥99%，批號：1-PQY-180-1）（Toronto Research Chemicals 公司）；茶堿（內(nèi)標(biāo)，純度≥99%，批號：YJX6-F86M，中國食品藥品檢定研究院）；羧甲基纖維素鈉（CMCNa）（上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司）；甲酸（Sigma-Alorich 公司）；乙腈、甲醇（Fisher 公司）；超純水由Millipore 超純水機(jī)制備。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證為：SCXK（京）2016-0006]。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，晝夜節(jié)律正常。

2 方法

2.1 色譜條件

Waters Xselect HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），柱溫35℃，進(jìn)樣體積5 μL，流速200 μL·min－1，流動(dòng)相A：0.1%甲酸水；流動(dòng)相B：0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫：0 ～5 min，45%A；5 ～9 min，12%A；9 ～11 min，45%A。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）；噴霧電壓為 3.8 kV；毛細(xì)管溫度為 350 ℃；鞘氣壓力為 35 psi；輔助氣流量為 5 arb，各化合物MRM 參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜優(yōu)化條件Tab 1 Mass spectrometry optimization conditions

2.3 溶液的制備

精密稱取APAP、APC、APG 對照品適量，用甲醇溶解并稀釋，分別制備成質(zhì)量濃度為5、0.1、5 mg·mL－1的儲備液；精密稱取茶堿對照品適量，用甲醇溶解并稀釋，制備成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL－1的儲備液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品前處理

取100 μL 待測血漿于1.5 mL EP 管中加入沉淀劑[0.1%甲酸甲醇溶液∶乙腈＝1∶1（V/V），含內(nèi)標(biāo)茶堿的終質(zhì)量濃度為600 ng·mL－1] 300μL，渦旋3 min，18 000 g 高速離心10 min，取上清液200 μL，真空離心揮干。進(jìn)樣分析前，各分析樣品以200 μL 的流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋3 min后，18 000 g 4 ℃離心5 min，取上清液置自動(dòng)進(jìn)樣瓶中進(jìn)行LC-MS/MS 分析。

2.5 分析方法驗(yàn)證

2.5.1 專屬性 取100 μL 空白血漿按“2.4”項(xiàng)下方法以等量不含內(nèi)標(biāo)的空白沉淀劑沉淀蛋白，取100 μL 空白血漿加入20 μL 3 種受試物質(zhì)的混合對照品（APAP 為800 ng·mL－1，APC 為12 ng·mL－1，APG 為800 ng·mL－1）以及100 μL 給藥后血漿（5 h）按“2.4”項(xiàng)下方法加入含內(nèi)標(biāo)的沉淀劑沉淀蛋白，離心揮干復(fù)溶處理后，LC-MS/MS 進(jìn)樣分析。比較空白血漿、空白血漿加混合對照品以及給藥后血漿的MRM 色譜圖，以考察方法的專屬性。結(jié)果表明，所建方法專屬性較高，分離較好，生物介質(zhì)中的雜質(zhì)峰不干擾樣品峰的測定（見圖1）。APAP、APC、APG 以及茶堿的保留時(shí)間分別為3.18、2.22、2.01 和3.65 min。

圖1 空白血漿（A），空白血漿＋對照品＋內(nèi)標(biāo)（B）及給藥后血漿樣品（C）中APAP、APC 和APG 的LC-MS/MS 色譜圖Fig 1 LC-MS/MS chromatogram of blank plasma（A），blank plasma ＋control ＋I(xiàn)S（B），and plasma sample after administration（C）

2.5.2 線性范圍 取100 μL 空白血漿，加入不同濃度APAP、APC、APG 的混合對照溶液20μL，使APAP 質(zhì)量濃度分別為100、200、800、1600、6400、12 800、51 200、102 400 ng·mL－1，APC 質(zhì)量濃度分別為1.5、3、12、24、96、192、768、1536 ng·mL－1，APG 質(zhì)量濃度分別為100、200、800、1600、6400、12 800、51 200、102 400 ng·mL－1，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析。以混合對照溶液質(zhì)量濃度（x，ng·mL－1）為橫坐標(biāo)，以對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行最小二乘法回歸，權(quán)重系數(shù)為1/χ。APAP 及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物APC、APG 在血漿中的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表2。

表2 分析物的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linearity，regression equation and correlation coefficients of analytes

2.5.3 定量限 標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度點(diǎn)定義為最低定量限（LLOQ），該點(diǎn)的精密度應(yīng)小于20%，其準(zhǔn)確度（RE%）應(yīng)介于－20%～20%。APAP及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物APG、APC 回歸方程具有良好的線性系數(shù)（r2＞0.99），其最低濃度精密度和準(zhǔn)確度均符合要求，見表3，故將其最低濃度定義為LLOQ，APAP、APC 和APG 的定量限分別為100、1.5 和100 ng·mL－1。

2.5.4 精密度和準(zhǔn)確度 取100 μL 空白血漿，按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制終質(zhì)量濃度，APAP 為100、800、6400、51 200 ng·mL－1，APC 為1.5、12、96、768 ng·mL－1，APG 為100、800、6400、51 200 ng·mL－1的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，每個(gè)濃度均重復(fù)5 份，連續(xù)測定3 批，計(jì)算樣品的濃度，進(jìn)行日間（n＝5）及日內(nèi)（n＝5）的準(zhǔn)確度和精密度考察，結(jié)果見表3。真實(shí)值與測定值的偏差程度在±15%內(nèi)，測定平均值與測定值的偏離程度（RSD%）低于15%，符合生物樣品測定的要求。

表3 血漿中分析物的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度、精密度Tab 3 Intra-and inter-day accuracy，precision of analyte in the plasma

2.5.5 提取回收率及基質(zhì)效應(yīng) 取100 μL 空白血漿，按下述兩種方式處置：① 按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制APAP 質(zhì)量濃度為100、800、6400、51 200 ng·mL－1，APC質(zhì)量濃度為1.5、12、96、768 ng·mL－1，APG 質(zhì)量濃度為100、800、6400、51 200 ng·mL－1的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣，獲得相應(yīng)的峰面積（A），按“2.4”項(xiàng)下樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析；② 按“2.4”項(xiàng)下方法處理后在復(fù)溶液中加入3種受試物質(zhì)的混合對照品溶液，使體系中的終濃度與上述對照品樣本相同后進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)的峰面積（B）；③ 同時(shí)以等量超純水代替空白血漿，依方式②處置，與空白介質(zhì)樣本平行操作，進(jìn)樣分析得相應(yīng)的峰面積值（C）。提取回收率以A/B（%）計(jì)算表示，基質(zhì)效應(yīng)以B/C（%）計(jì)算表示。

血漿中的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)的結(jié)果見表4。APAP、APC、APG 的基質(zhì)效應(yīng)介于 87.46%～103.43%。APAP、APC 和APG 的提取回收率分別為90.12%～100.66%、87.61%～99.64%和86.59%～94.20%，表明3 種物質(zhì)在所建立的樣品處理?xiàng)l件下提取回收率良好，且基本無基質(zhì)干擾。

表4 血漿中分析物的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n ＝5，%)Tab 4 Matrix effect and extraction recovery of analyte in the plasma (n ＝5，%)

2.5.6 穩(wěn)定性 取100 μL 空白血漿，按“2.5.2”項(xiàng)下方法配制終質(zhì)量濃度APAP 為800、6400、512 00 ng·mL－1，APC 為12、96、768 ng·mL－1，APG 為800、6400、512 00 ng·mL－1的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣本，分別考察室溫放置8 h，冷凍（－80℃）-解凍（37℃）循環(huán)3 次，－80℃存放1 周在樣品盤內(nèi)（4℃）放置24 h 的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，APAP、APC、APG 均具有較好的穩(wěn)定性（見表5）。

表5 血漿中QCs 濃度下分析物的穩(wěn)定性Tab 5 Stability of analyte at QCs concentration in the plasma

3 藥動(dòng)學(xué)考察

3.1 藥物制備

3.1.1 柴胡水提液 稱取適量北柴胡生藥飲片，浸泡30 min，首次加10 倍水煎煮1.5 h，第二次加8.5 倍水煎煮1.5 h，將所得藥汁水提醇沉24 h后過濾，得到柴胡水提液，每1 mL 水提液含生藥3.8 g（本提取液由南通精華藥業(yè)公司協(xié)助制備）。

3.1.2 APAP 溶液的制備 稱取APAP 適量，研細(xì)，以5%CMC-Na 為溶媒使其分散均勻，制備濃度為60 mg·mL－1的APAP 混懸液。

3.2 分組及給藥

大鼠實(shí)驗(yàn)前于實(shí)驗(yàn)室屏障系統(tǒng)內(nèi)喂養(yǎng)1 周，每日給予食物與飲用水，APAP 給藥前禁食12 h，飲水自由。將24 只大鼠按體重隨機(jī)分為4 組，包括溶媒對照組（5% CMC-Na）、APAP 對照組（1.2 g·kg－1）、柴胡低劑量（6 g·kg－1）預(yù)給藥組、柴胡高劑量（25 g·kg－1）預(yù)給藥組。溶媒對照組和APAP 對照組前3 d 給予0.9%氯化鈉溶液，每日一次；預(yù)給藥組前3 d 以各劑量的柴胡水提液灌胃，每日一次。于第3日末次給藥6 h 后按體重以1.2 g·kg－1給予APAP，對照組給予5%CMC-Na 溶液。

3.3 生物樣本采集及處理

依次于APAP 給藥后的5 min、10 min、20 min、40 min、1 h、2、3、5、10、24、31、48 h 于大鼠眼底靜脈叢取血200 μL 置含肝素化的1.5 mL EP 管中，3000 g 離心10 min，吸取上清血漿，于－80℃冰箱保存。測定時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析。

3.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Thermo TSQ Quantum Access 定量處理軟件處理并計(jì)算各物質(zhì)的濃度。根據(jù)測定結(jié)果考察不同組別APAP 及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物的血藥濃度-時(shí)間曲線，并利用DAS 3.2.7 軟件（中國數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會）對不同組別的血藥濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，按照非房室模型計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，包括藥時(shí)曲線下面積（AUC0→t）、峰濃度（Cmax）、達(dá)峰時(shí)間（tmax）、半衰期（t1/2）、清除率（CL）以及平均駐留時(shí)間（MRT0→t）。不同給藥組間的數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 5 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本間的兩兩t檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

根據(jù)測定結(jié)果考察不同組別中APAP 及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物的血藥濃度-時(shí)間曲線，比較了不同組別藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，由表6可知，預(yù)給藥3 d 柴胡低、高劑量預(yù)給藥組（3RBL ＋APAP，3RBH ＋APAP）中，APAP 毒性中間體谷胱甘肽結(jié)合物NAPQI-GSH的水解產(chǎn)物APC、Ⅱ相葡萄糖醛酸結(jié)合物APG 與APAP 的峰濃度存在顯著差異。

表6 APAP 及其毒性相關(guān)代謝物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n ＝5)Tab 6 Pharmacokinetic parameters of APAP and its toxicity related metabolites (mean±SD，n ＝5)

通過對曲線及參數(shù)的綜合分析可以看出，與APAP 組相比，柴胡低、高劑量預(yù)給藥組，APAP及其毒性相關(guān)代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線及AUC0→t均無顯著差異，但柴胡高劑量預(yù)給藥組，APAP 的Cmax體內(nèi)暴露水平有所下降，但差異無顯著性。在柴胡低、高劑量預(yù)給藥組，Ⅱ相葡萄糖醛酸結(jié)合物APG 的Cmax則顯著升高；APAP 毒性中間體谷胱甘肽結(jié)合物NAPQIGSH 的水解產(chǎn)物APC 的Cmax顯著下降，提示NAPQI-GSH 及NAPQI 的Cmax出現(xiàn)短時(shí)下降，表明APAP 所致急性損傷的減毒作用可能與其活性體NAPQI 短時(shí)暴露量的降低有關(guān)（見圖2）。

圖2 雄性Wistar 大鼠APAP（A）、APC（B）、APG（C）的血藥濃度-時(shí)間曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Fig 2 Plasma concentration-time profiles and pharmacokinetic parameters of APAP（A），APC（B）and APG（C）in male Wistar rats

5 討論

大量文獻(xiàn)表明，APAP 毒性作用的產(chǎn)生是由于經(jīng)CYP450 酶代謝生成的活性中間體NAPQI 在體內(nèi)大量蓄積因GSH 的耗竭而導(dǎo)致與肝細(xì)胞蛋白結(jié)合引起肝損傷，正常劑量下，85%～90%的APAP 通過葡萄糖醛酸化或硫酸化生成Ⅱ相代謝產(chǎn)物由尿液中排出體外，而＜10%的原形藥物則經(jīng)Ⅰ相代謝產(chǎn)生NAPQI 后形成NAPQI-GSH，并迅速水解生成APC 轉(zhuǎn)化為無毒代謝產(chǎn)物[8-11]。由于APAP 毒性代謝產(chǎn)物NAPQI 為活性中間體不穩(wěn)定，同時(shí)未能得到NAPQI-GSH 對照品，且有研究表明急性肝損傷患者血漿中APC 濃度與血生化指標(biāo)成正相關(guān)，其可作為標(biāo)志物表征APAP 肝損傷的毒性代謝過程[12-14]，因而考察柴胡預(yù)給藥對APAP 及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高劑量柴胡預(yù)給藥后降低了APAP 在體內(nèi)的峰濃度，一方面通過增加Ⅱ相代謝葡萄糖醛酸化產(chǎn)物APG 的生成，加速其排泄過程，從而減少APAP 向NAPQI 的轉(zhuǎn)化；另一方面發(fā)現(xiàn)APC 的峰濃度下降具有顯著性差異，推測可能由于APAP Ⅱ相代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的增加使其受到影響，同時(shí)也可能由于NAPQI 活性中間體的減少致使NAPQI-GSH 下降影響下游代謝產(chǎn)物APC 水平，其中Cmax下降至關(guān)重要，避免了短時(shí)內(nèi)NAPQI 的大量蓄積、耗竭GSH 而產(chǎn)生肝毒性的可能。由于Ⅰ相代謝與NAPQI 的產(chǎn)生直接相關(guān)，為探究柴胡對APAP 的減毒作用機(jī)制，有必要對APAP Ⅰ相代謝相關(guān)的CYP450 酶進(jìn)行下一步研究。