甘草炭納米類成分對(duì)應(yīng)激性胃潰瘍大鼠的保護(hù)作用研究

劉楚妤，劉育含，吳佳姝，趙亞芳，鐘琪，孔慧，屈會(huì)化（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 00029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 00029）

應(yīng)激性胃潰瘍（stress-induced gastric ulcer，SGU）是指機(jī)體在受到如休克、創(chuàng)傷、手術(shù)、危重疾病或嚴(yán)重心理疾病等強(qiáng)烈刺激后發(fā)生的以炎性糜爛、淺表潰瘍及出血為特征的急性胃黏膜病變，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。

甘草在《神農(nóng)本草經(jīng)》中歸為上品，2015年版《中國藥典》記載甘草：“性味甘、平；歸心、肺、脾、胃經(jīng)”，具有補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用[1]。張仲景在《傷寒雜病論》中的260 個(gè)方劑中（重復(fù)方、異名方及附方未計(jì)入）共有125 方涉及甘草[2]。而在《傷寒論》中含甘草的 70 首方劑中應(yīng)用炙甘草者多達(dá)68 首，可見炙甘草在配伍中的重要性。本團(tuán)隊(duì)在前期考證發(fā)現(xiàn)張仲景所用炙甘草并非蜜炙甘草而是炒甘草，其本質(zhì)是將甘草部分碳化[3]，且已經(jīng)在荊芥炭、麥芽炭、葛根炭、枳實(shí)炭、蒲黃炭等中藥炭藥中發(fā)現(xiàn)了納米類成分，并證明這些納米類成分具有較好的止血、降糖、鎮(zhèn)痛、保肝、抗炎、降尿酸、增溶等效果[4-10]。同時(shí)也在甘草炭中發(fā)現(xiàn)了納米類成分，并命名為GRRC-NCs，通過小鼠急性酒精性胃潰瘍模型證明其具有抗?jié)冏饔肹11]。本實(shí)驗(yàn)利用水浸拘束法制備大鼠SGU 模型，進(jìn)一步探究GRRC-NCs 對(duì)SGU 的保護(hù)作用，為GRRC-NCs 的應(yīng)用提供新思路。

1 材料

1.1 儀器

PXR-9 馬弗爐（北京中科奧博科技有限公司）；PFT-100A 高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；HH-1 水浴鍋（金壇市畫成開元實(shí)驗(yàn)儀器廠）；SA1245-CW 電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；84-1A 磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；DRP-9082 恒溫孵育箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；組織勻漿機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）；Biotek 酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 試藥

生甘草（北京仟草中藥飲片有限公司，產(chǎn)地新疆，批號(hào)：190711008）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：2008012003）；45-1000DRC膜透析袋（北京拜爾迪科技有限公司，批號(hào)：132640-2007）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99.5%，批號(hào)：20150508）；鹽酸雷尼替丁（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號(hào)：Y29D7C27738）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒、五羥色胺（5-HT）ELISA 試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司）；水為去離子水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性健康SD大鼠48只，體質(zhì)量180 ～220 g [北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：110324201103658567]。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房內(nèi)，保持空氣濕度55%～65%，室溫（24±1）℃，環(huán)境安靜，動(dòng)物隨意進(jìn)食飲水，明暗12 h 循環(huán)飼養(yǎng)。所有動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前24 h 禁食不禁水。

2 方法

2.1 GRRC-NCs 制備

按照本實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)前期研究確定的步驟燒制甘草炭并制備GRRC-NCs[11]。制備過程如下：稱取600 g 甘草生藥置于坩堝中，使用鋁箔紙密封加蓋于馬弗爐中燒制。馬弗爐程序升溫：第一階段5 min 升溫至100℃，保溫30 min；第二階段25 min 升溫至375℃，保溫1 h。將燒制好的甘草炭置于中藥粉碎機(jī)中粉碎。每次稱取甘草炭粉末50 g，放于30 倍去離子水中用水浴鍋加熱兩次，溫度設(shè)置為100℃，時(shí)間為1 h，并用玻璃棒攪拌，使炭粉均勻受熱，充分煎煮。將每次所得溶液用濾紙粗濾殘?jiān)笤儆?.22 μm 微孔濾膜過濾，將兩次濾液合并，濃縮并裝入透析袋中透析7 d，定期換水。7 d 后取出透析液于4℃保存，留置待用。

2.2 GRRC-NCs 表征

取2 mL GRRC-NCs 透析液超聲分散20 min，微孔濾膜過濾后抽取少量樣品滴于200 目電鏡專用銅網(wǎng)上，自然干燥后置于TEM 中，觀察GRRC-NCs 的微觀特征，并利用HR-TEM 觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。利用UV-Vis 和FT-IR 觀察GRRC-NCs的光學(xué)特征和表面官能團(tuán)情況。將UV-Vis 預(yù)熱30 min，用去離子水測定基線，測試條件：波長掃描范圍為200 ～600 nm，帶寬1.8 nm，速度5 nm·s－1。取3 mL GRRC-NCs 稀釋液于比色皿中，測定其紫外光譜。稱取160 mg KBr 粉末并將其與20 μL GRRC-NCs 透析液混合，烘干后研成細(xì)粉，并壓制成質(zhì)地透明的樣片，測定GRRC-NCs紅外吸收光譜。

2.3 水浸拘束法致大鼠應(yīng)激性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)

大鼠同一環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨后將其隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽性藥雷尼替丁組（50 mg·kg－1）及GRRC-NCs 低、中、高劑量組，共6 組，每組8 只。對(duì)照組與模型組給予生理鹽水，GRRC-NCs 給藥組劑量按成人用藥劑量每日0.143 g·kg－1[1]、0.394 g·kg－1、0.789 g·kg－1[12-13]換算成大鼠用藥劑量為0.85 g·kg－1、2.37 g·kg－1、4.73 g·kg－1（以GRRC 的質(zhì)量計(jì)算）。每組灌胃體積均為10 mL·kg－1，每日給藥一次，連續(xù)灌胃5 d。給藥第4日后開始禁食，期間自由飲水，共計(jì)24 h。末次灌胃給藥30 min 后造模，除對(duì)照組外各組大鼠放入自制大鼠固定器，浸入22～24 ℃水中，水面平于胸骨劍突，6 h 后取出。

2.4 標(biāo)本采集與檢測

造模結(jié)束后立即腹腔注射4%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h 后，4℃3000 r·min－1離心15 min 分離血清，按照ELISA 試劑盒說明書測定血清中IL-6、TNF-α、5-HT 的含量。結(jié)扎幽門和賁門，收集胃液，pH 試紙檢測胃液pH 值。取出全胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水清洗胃內(nèi)容物后用濾紙吸干，將胃黏膜向上展開平鋪于冰上，觀察其損傷情況。拍照記錄評(píng)價(jià)潰瘍程度后，剪取一半胃組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE 染色觀察胃組織病理變化。

胃黏膜潰瘍指數(shù)（UI）采用評(píng)分法簡介評(píng)分，按Guth[14]標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算分值：斑點(diǎn)狀糜爛計(jì)1 分，潰瘍糜爛長度＜1 mm 計(jì)2 分，潰瘍糜爛長度在1 ～2 mm 計(jì)3 分，潰瘍糜爛長度在2 ～3 mm 計(jì)4 分，糜爛長度＞3 mm 計(jì)5 分，寬度＞1 mm 時(shí)分值×2，最后將所得分相加。

潰瘍抑制率/%＝（模型組平均UI－給藥組平均UI）/模型組平均UI×100%。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以±s表示。多組間比較采用單因素ANOVA 方差分析方法，組間兩兩比較則運(yùn)用LSD 方法分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 GRRC-NCs 表征結(jié)果

利用TEM 觀察GRRC-NCs 的微觀特征，見圖1A，GRRC-NCs 粒徑分布比較均一，在0.8 ～4.8 nm，主要集中在2 nm 左右，符合正態(tài)分布特征（見圖1B）。高分辨透射電鏡結(jié)果顯示，GRRC-NCs 呈類球形，晶格間距為0.319 nm，晶格結(jié)構(gòu)清晰（見圖1C）。根據(jù)UV-vis 結(jié)果顯示，GRRC-NCs 在255 nm 左右可見一微弱的吸收峰，這可能是由于C、O、N 元素的n-σ*躍遷所致（見圖1D）。根據(jù)FT-IR 結(jié)果顯示，紅外吸收峰分別為3431、2921、1630、1384、1036 cm－1，提 示GRRC-NCs 表面存在氨基、羰基和羥基等功能基團(tuán)（見圖1E）。根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]分析可知吸收峰在3431 cm－1提示為-OH 和-NH 的伸縮振動(dòng)峰，2921 cm－1處的吸收峰提示為CH3-和CH2-中的C-H 伸縮振動(dòng)峰，1630 cm－1處的吸收峰提示可能為-C ＝O 鍵的伸縮振動(dòng)峰，1384 cm－1處的吸收峰提示可能為C-N 的彎曲振動(dòng)，1036 cm－1處的吸收峰提示可能為C-O 鍵的伸縮振動(dòng)峰。

圖1 GRRC-NCs 的微觀結(jié)構(gòu)及光譜特征組圖Fig 1 Microstructure and spectral characteristic group of GRRC-NCs

3.2 藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 GRRC-NCs 對(duì)大鼠胃組織形態(tài)學(xué)的影響 如圖2所示，對(duì)照組大鼠胃黏膜完整光滑，無損傷性改變，可見生理性皺襞。模型組胃黏膜充血糜爛，可見大量出血點(diǎn)及條索狀血痂，呈黑褐色，清洗時(shí)有血塊脫落，胃黏膜損傷嚴(yán)重。與模型組相比，各給藥組胃黏膜出血情況均有減輕。其中GRRC-NCs 高劑量組和低劑量組仍有較明顯的點(diǎn)狀、線狀出血及潰瘍面，而GRRC-NCs 中劑量組和陽性藥雷尼替丁組偶見輕微點(diǎn)狀或短線狀出血，部分大鼠胃黏膜無肉眼可見損傷。

3.2.2 GRRC-NCs 對(duì)大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率的影響 如圖2A 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的潰瘍指數(shù)具有顯著差異（P＜0.01）；與模型組相比，陽性對(duì)照組和GRRC-NCs 各劑量組潰瘍指數(shù)明顯減少（P＜0.01），其中GRRCNCs 中劑量組的潰瘍指數(shù)低于陽性藥雷尼替丁組（P＜0.05）。且GRRC-NCs 中劑量組潰瘍抑制率為85.88%，明顯高于陽性藥組的65.54%（見圖2B）。

圖2 GRRC-NCs 對(duì)大鼠胃潰瘍程度的影響Fig 2 Effect of GRRC-NCs on the degree of gastric ulcer in rats

3.2.3 GRRC-NCs 對(duì)SGU 大鼠胃組織病理學(xué)的影響 如圖3所示，對(duì)照組大鼠胃組織黏膜無損傷。模型組大鼠胃組織黏膜可見明顯帶狀損傷，上皮不完整，腺體紊亂，紅細(xì)胞溢出明顯，黏膜表面有較多組織碎片。陽性藥組損傷及出血范圍較小，腺體排列整齊。GRRC-NCs 低劑量組仍有明顯出血及損傷，GRRC-NCs 高劑量組紅細(xì)胞溢出不明顯，但腺體排列不整齊，GRRC-NCs 中劑量組上皮黏膜連續(xù)完整，腺體結(jié)構(gòu)整齊，出血不明顯。

圖3 應(yīng)激性胃潰瘍大鼠胃組織病理學(xué)切片（HE，×100）Fig 3 Pathological section of stomach in rat with stress gastric ulcer（HE，×100）

3.2.4 GRRC-NCs 對(duì)大鼠胃液pH 值的影響 如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組胃液pH 值明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組胃液pH 值均有升高，其中GRRC-NCs 中劑量組與陽性藥組有明顯升高（P＜0.01），GRRC-NCs 低劑量與高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明GRRC-NCs 能夠升高胃液pH 值，減少胃酸對(duì)胃黏膜的損害。

圖4 GRRC-NCs 對(duì)大鼠胃液pH 值的影響Fig 4 Effect of GRRC-NCs on pH value of gastric juice in rats

3.2.5 GRRC-NCs 對(duì)大鼠血清中TNF-α、IL-6 及5-HT 的影響 如圖5A 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TNF-α含量均有明顯降低（P＜0.01）。如圖5B 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-6 含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組IL-6 含量均有降低，其中陽性藥組與GRRC-NCs 中、高劑量組有顯著差異（P＜0.01），GRRC-NCs 低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖5C 所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中5-HT 明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組5-HT 含量均有明顯降低（P＜0.01）。

圖5 GRRC-NCs 對(duì)大鼠血清炎癥因子和五羥色胺含量的影響Fig 5 Effect of GRRC-NCs on serum inflammatory factors and serotonin in rats

4 討論

近年來，隨著納米技術(shù)的深入研究，碳點(diǎn)因?yàn)榫哂辛己玫纳锵嗳菪约鞍踩允蛊湓谏锍上瘛⒓膊√綔y、細(xì)胞標(biāo)記等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[17-19]。在前期工作中，本團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明了碳點(diǎn)是炭藥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，且具有良好的止血、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。前期研究中本團(tuán)隊(duì)通過酒精性胃潰瘍模型，發(fā)現(xiàn)GRRC-NCs 可以提高機(jī)體的抗氧化能力，減輕酒精代謝過程中產(chǎn)生的自由基，從而降低胃潰瘍程度[11]。本研究初步證實(shí)GRRC-NCs 是通過降低損傷因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)，來保護(hù)胃組織。

SGU 是消化系統(tǒng)的常見病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明SGU 是機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境刺激作出的非特異性防御適應(yīng)反應(yīng)，受到整體因素如神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)的調(diào)節(jié)。其中樞機(jī)制可能是通過下丘腦-交感神經(jīng)系統(tǒng)、下丘腦-迷走神經(jīng)系統(tǒng)及下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA 軸）發(fā)揮作用，并進(jìn)一步影響胃酸分泌及胃黏膜血流量導(dǎo)致潰瘍產(chǎn)生[20]。胃酸是導(dǎo)致胃黏膜損傷的主要因素之一，而應(yīng)激后機(jī)體交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)興奮性增加，使胃腸道運(yùn)動(dòng)和胃酸分泌紊亂，造成胃黏膜損傷并產(chǎn)生炎癥。當(dāng)炎性因子過量表達(dá)，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，使胃黏膜免疫反應(yīng)過度亢進(jìn)導(dǎo)致胃損傷。TNF-α是可造成組織廣泛損傷的促炎癥因子，影響潰瘍愈合質(zhì)量。TNF-α高濃度時(shí)還能促進(jìn)IL-6 等相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生及分泌[21]。有研究表明IL-6 通過興奮中樞迷走神經(jīng)膽堿能神經(jīng)元，導(dǎo)致外周胃泌酸的增加以及胃分泌功能紊亂，從而加重了SGU 的形成[22]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT 與水浸拘束應(yīng)激有密切的關(guān)系，是應(yīng)激中很活躍的神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。5-HT含量的改變，能引起下丘腦、垂體功能的相應(yīng)變化，外圍或中樞給予5-HT 可影響胃酸分泌[23]。5-HT 通過其受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，具有抑制胃酸和胃蛋白酶的分泌，加速胃腸道收縮、蠕動(dòng)及參與腸液的分泌及腸道對(duì)電解質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用[24]。

綜上所述，GRRC-NCs 對(duì)SGU 大鼠胃黏膜組織有明顯保護(hù)作用，為甘草炭和其他炭藥的研究提供了新的理論基礎(chǔ)。這不僅為中藥炭藥的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一個(gè)新思路，也為GRRC-NCs在胃潰瘍領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的見解，并為未來的藥物發(fā)現(xiàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。