PART1對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、侵襲和凋亡的影響及其機(jī)制*

閆大勇, 蔡曉清, 呂繼連, 裴飛, 常曉云, 張瑞

鄭州市中心醫(yī)院口腔頜面外科(河南鄭州 450001)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)最常見(jiàn)的類(lèi)型，占口腔惡性腫瘤的90%[1]。其惡性程度高，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。目前口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療手段主要包括：手術(shù)、化療、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)抑制劑，環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)抑制劑和光動(dòng)力療法[2]。盡管近年來(lái)口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療方式不斷進(jìn)步，晚期患者的治療效果仍不理想。因此探討口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的靶向治療分子，對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療十分重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200 nt的單鏈非編碼RNA。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，lncRNA參與調(diào)控腫瘤的增殖、遷移、侵襲和凋亡過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到非常重要的作用[3]。LncRNA前列腺雄激素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子 1(prostate androgen-regulated transcript 1, PART1)最初在前列腺癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，研究表明其受雄激素轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)PART1在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過(guò)Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor pathway, TLR pathway)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡[5]。PART1在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中也同樣呈高表達(dá)，并與NSCLC患者不良預(yù)后相關(guān)[6]。除此之外，有研究者發(fā)現(xiàn)PART1在膠質(zhì)瘤中呈低表達(dá)，過(guò)表達(dá)PART1抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。說(shuō)明PART1在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中既可發(fā)揮促癌作用，也可發(fā)揮抑癌作用，但PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用尚不明確。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)PART1，探討PART1對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本采集 收集鄭州市中心醫(yī)院2018年9月至2019年5月間，口腔鱗癌手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本54例及癌旁組織標(biāo)本54例。選擇要求如下：(1)術(shù)前及術(shù)后病理證實(shí)為口腔鱗癌；(2)患者術(shù)前未行放療、化療及其他治療；(3)術(shù)后病理取材部位包括表面區(qū)、中心區(qū)、深層浸潤(rùn)區(qū)、癌旁組織；(4)本研究納入54例研究對(duì)象，男37例，女17例，年齡27～71歲，平均57.6歲，T1期23例，T2期18例；T3期13例。所有程序經(jīng)鄭州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TSCCA、SCC-4、SCC-9、SCC-15、Cal-27及人正常黏膜細(xì)胞株NHOK均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)的RMPI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)液內(nèi)含有青霉素100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL。細(xì)胞均置于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。SCC-9或SCC-15細(xì)胞各分為兩組，即對(duì)照空載組和PART1過(guò)表達(dá)組。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)將pcDNA3.1空載體或者pcDNA3.1-PART1轉(zhuǎn)染至SCC-9或SCC-15細(xì)胞。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR) 采用Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)提取組織或細(xì)胞中的總RNA，操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)；用PrimeScript RT reagent(大連寶生物公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物序列(美國(guó)Invitrogen公司)：PART1上游：5′-AAGGCCGTGTCAGAACTCAA-3′；PART1下游：5′-GTTTTCCATCTCAGCCTGGA-3′；GAPDH上游：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3′; GAPDH下游：5′-GAGGTCAATGAAGGGGTCATTG-3′。Excel計(jì)算ΔC(t)值(2-ΔΔCt表示目的基因表達(dá))。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將轉(zhuǎn)染后的SCC-9和SCC-15細(xì)胞接種至96孔板中，分別培養(yǎng)24、48和72 h后，更換新鮮培養(yǎng)液。每孔中加入10 μL CCK-8試劑(碧云天公司)，在37℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度。每組設(shè)置至少3個(gè)復(fù)孔。

1.5 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力 進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)前用Matrigel(美國(guó)BD公司)預(yù)包被Transwell上室，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)不需預(yù)包被處理。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞懸液加入Transwell上室培養(yǎng)，Transwell下室加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。細(xì)胞于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，用棉簽小心擦去Transwell上室細(xì)胞。4%多聚甲醛固定后以0.1%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下觀察。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.6 蛋白提取及Western印跡 采用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度(美國(guó)Pierce公司)。等量的細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別孵育anti-E-cadherin(1∶1 000；美國(guó)Invitrogen公司)，anti-vimentin (1∶1 000；美國(guó)Santa Cruz公司), anti-p-PI3K (1∶1 000；美國(guó)CST公司), anti-PI3K(1∶1 000；美國(guó)CST公司), anti-p-AKT(1∶1 000；美國(guó)CST公司)，anti-AKT(1∶1 000；美國(guó)CST公司)和anti-GAPDH(1∶1 000；美國(guó)Santa Cruz公司)一抗于4℃過(guò)夜。隔天洗膜后室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的對(duì)應(yīng)二抗1 h。采用ECL發(fā)光液(美國(guó)Pierce公司)后用成像系統(tǒng)檢測(cè)。采用ImageJ軟件進(jìn)行圖像分析，GAPDH為內(nèi)參。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI染色，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)消化后以binding buffer重懸，加入Annexin-V-FITC避光染色30 min，加入PI染色。流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Annexin V陽(yáng)性為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V和PI雙陽(yáng)性為晚期凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)鏈非編碼RNA PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中呈低表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)量顯著低于相應(yīng)的癌旁正常組織(P<0.001)，見(jiàn)表1。與正常黏膜細(xì)胞NHOK相比，口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCC-9、SCC-15、SCC-4、TSCCA和 Cal-27中PART1 mRNA水平亦相對(duì)較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

表2 PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2 過(guò)表達(dá)PART1顯著抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖 為了進(jìn)一步研究PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的功能，選取PART1表達(dá)相對(duì)較低的SCC-9和SCC-15細(xì)胞系轉(zhuǎn)染PART1過(guò)表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染后48 h，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)PART1顯著提高PART1在口腔鱗狀癌細(xì)胞SCC-9和SCC-15中的表達(dá)(P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 轉(zhuǎn)染組和空載組PART1基因表達(dá)比較

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)PART1后，SCC-9和SCC-15細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，相對(duì)存活率與對(duì)照組細(xì)胞相比，24 h、48 h和72 h在SCC-9細(xì)胞(P<0.01，P<0.001，P<0.001)及SCC-15細(xì)胞(P<0.05，P<0.001，P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表4。

表4 轉(zhuǎn)染組和空載組增殖比較

2.3 過(guò)表達(dá)PART1顯著抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲 Transwell細(xì)胞遷移和侵襲 與轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)PART1后，SCC-9和SCC-15細(xì)胞的遷移(P<0.05)和侵襲(P<0.05)能力顯著下降。見(jiàn)圖1。

圖1 過(guò)表達(dá)PART1對(duì)SCC-9和SCC-15細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響(×400)

2.4 過(guò)表達(dá)PART1顯著抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) 我們隨后檢測(cè)了EMT相關(guān)鈣黏著蛋白E-cadherin和波形蛋白vimentin的表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)PART1的SCC-9和SCC-15細(xì)胞中E-cadherin水平明顯升高(P<0.05)，而vimentin水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 過(guò)表達(dá)PART1對(duì)SCC-9和SCC-15細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)PART1顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)顯示，過(guò)表達(dá)PART1顯著增加SCC-9和SCC-15細(xì)胞凋亡率。SCC-9細(xì)胞對(duì)照組凋亡率為(13.24±1.52)%，過(guò)表達(dá)PART1后細(xì)胞凋亡率為(37.90±3.81)%；SCC-15細(xì)胞對(duì)照組凋亡率為(15.15±2.24)%，過(guò)表達(dá)PART1后細(xì)胞凋亡率為(26.61±2.08)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)PART1誘導(dǎo)SCC-9和SCC-15細(xì)胞凋亡

2.6 過(guò)表達(dá)PART1抑制PI3K/AKT信號(hào)通路 Western印跡結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)PART1顯著抑制磷酸化PI3K和磷酸化AKT在SCC-9和SCC-15細(xì)胞中的表達(dá)，PI3K和AKT總蛋白水平未見(jiàn)明顯差異(圖4,表5)，p-PI3K/PI3K及p-AKT/AKT差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 過(guò)表達(dá)PART1抑制PI3K/AKT信號(hào)通路

表5 轉(zhuǎn)染組和空載組PART1相關(guān)基因及蛋白表達(dá)比較

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的頭頸惡性腫瘤，約占頭頸腫瘤的90%。全球每年約640 000新發(fā)病例，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]?？谇击[狀細(xì)胞癌局部侵襲能力強(qiáng)，易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后較差，5年生存率低于50%[8-10]。因此探討口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制并尋找新的治療靶標(biāo)對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的診療水平的提高具有重要意義。

近年來(lái)大量研究表明lncRNA參與調(diào)控腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等過(guò)程[3]。LncRNA可直接參與調(diào)控基因表達(dá)，也可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)機(jī)制參與調(diào)控。LncRNA作為microRNA(miRNA)的海綿(sponge)吸附miRNA，進(jìn)而調(diào)控靶基因mRNA水平[11-12]。PART1對(duì)于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的調(diào)控作用比較復(fù)雜，其在不同的腫瘤中分別發(fā)揮促癌和抑癌的功能[5-7]。PART1在前列腺癌細(xì)胞中通過(guò)抑制TLR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡[5]。近期在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，PART1通過(guò)吸附miR-190a-3p并抑制PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮抑癌功能[7]。針對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌和舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma, TSCC)的lncRNA表達(dá)譜分析表明PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌、舌鱗狀細(xì)胞癌中呈低表達(dá)，且與生存率相關(guān)，提示PART1是口腔鱗狀細(xì)胞癌潛在的預(yù)后因素[13-14]。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中PART1的表達(dá)水平，結(jié)果表明PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，與lncRNA表達(dá)譜分析的結(jié)果一致。

本研究首次探索了PART1對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，提示PART1可能在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌功能。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)PART1抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PART1的細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室的遷移和侵襲能力明顯減弱。EMT在口腔鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[15-17]，因此我們檢測(cè)了過(guò)表達(dá)PART1后上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間葉表型標(biāo)記物vimentin的表達(dá)水平。Western印跡結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)PART1上調(diào)E-cadherin，而下調(diào)vimentin。說(shuō)明PART1使上皮細(xì)胞極性增加，間質(zhì)特性減弱，抑制EMT而使腫瘤細(xì)胞侵襲性減弱。另外，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PART1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明PART1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抑癌功能。

PART1在膠質(zhì)瘤中上調(diào)PTEN，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路[7]。與膠質(zhì)瘤中研究相似的是，我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細(xì)胞癌中過(guò)表達(dá)PART1抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。PI3K/AKT信號(hào)通路在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)增殖等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-20]，提示PI3K/AKT信號(hào)通路可能參與PART1抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等過(guò)程，后續(xù)可通過(guò)敲低實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/AKT信號(hào)通路的作用。本研究仍存在一些不足之處，PART1上下游調(diào)控分子有待進(jìn)一步探索。本研究結(jié)論有待通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，長(zhǎng)鏈非編碼RNA PART1可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制口腔鱗狀癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡。PART1可能作為新型腫瘤標(biāo)志物為口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)。