小鼠APOBEC3的結(jié)構(gòu)與功能分析

吳小霞，許天委，李國寅

(瓊臺師范學院 瓊臺兒童認知與行為發(fā)展研究中心，?？?571127)

2002年，Sheehy等[1]通過消減克隆方法首次發(fā)現(xiàn)了宿主限制因子CEM15(即APOBEC3G，簡稱A3G)，作為生命體重要的防御蛋白，APOBEC3(簡稱A3)胞嘧啶脫氨酶家族也就成為研究的熱點，隨后的研究中又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了位于人體22號染色體上的其他A3成員。哺乳動物A3可利用其胞嘧啶脫氨酶活性將慢病毒負鏈DNA上的C脫氨基成為U，從而導(dǎo)致正鏈DNA上的G→A超突變而抑制慢病毒復(fù)制，可通過引起病毒基因組中的突變和阻斷逆轉(zhuǎn)錄來限制逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，雖然這兩種限制方法在體外都起作用，但在體內(nèi)感染期間它們的作用知之甚少[2]。

哺乳動物A3基因在一個CBX6和CBX7兩側(cè)的染色體位點復(fù)制，A3基因的數(shù)量和A3復(fù)制過程的歷史在每個哺乳動物譜系都是不同的[3]。小鼠只有一個A3(mA3)基因，mA3可誘發(fā)CTL免疫應(yīng)答并產(chǎn)生針對Friend逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的中和抗體[4]。人類有七個A3基因，而hA3G是A3家族中最明確的抗HIV-1蛋白[4]。Wang等[5]認為靶向hA3G可通過減弱DNA修復(fù)途徑的激活而使癌細胞對輻射誘導(dǎo)的細胞死亡敏感。癌癥基因組學的最新進展以及A3酶的生物化學表征現(xiàn)在已經(jīng)暗示至少兩個家族成員在腫瘤發(fā)展期間進行體細胞誘變[6]。Huff 等[7]認為B16細胞中A3基因的敲除降低了體外抵抗水皰性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，簡稱VSV)感染的能力，提高了體內(nèi)VSV的治療效果。

總之，A3家族是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒、逆轉(zhuǎn)錄元件的抑制因子具有重要的免疫功能，最近A3在癌癥發(fā)生中的作用也被發(fā)現(xiàn)[8]。因此，研究hA3G與mA3的結(jié)構(gòu)有助于進一步了解其功能及其在生物進化中的作用。本文利用生物信息學方法對mA3和hA3G的結(jié)構(gòu)進行分析，以進一步加深對其抗病毒等功能的了解，為研究其作用機制、設(shè)計疫苗、治療癌癥等提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

本文在NCBI數(shù)據(jù)庫收集hA3G及mA3蛋白的序列信息，選擇hA3G(檢索號：AAH24268.1 )與mA3(檢索號ACH89412.1)進行研究。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)序列比對

輸入網(wǎng)址https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/，點擊Launch Clustal Omega，分別將hA3G與mA3的蛋白序列fasta格式輸入，對二者的蛋白質(zhì)序列進行比對。

1.2.2 理化性質(zhì)分析

輸入網(wǎng)址https://www.expasy.org/proteomics，在ExPASy數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)選擇ProtParam工具，分析hA3G和mA3的分子量、分子式、酸堿性和穩(wěn)定性等理化性質(zhì)。輸入網(wǎng)址https://www.expasy.org/proteomics，點擊Protscale，使用Protscale工具，點擊輸入hA3G和mA3蛋白序列，分析hA3G和mA3的親疏水性。

1.2.3 亞細胞定位預(yù)測

輸入網(wǎng)址http://psort.hgc.jp，PSORTⅡPrediction，分別輸入hA3G與mA3的蛋白序列，點擊submit，進行亞細胞定位預(yù)測。

1.2.4 二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)分析

輸入網(wǎng)址http://www.cbs.dtu.dk/，選擇Prediction Servers，利用TMHMM2.0工具，將hAG和mA3的蛋白序列分別輸入，對hA3G和mA3的跨膜區(qū)域進行分析。輸入網(wǎng)址https://npsa-prabi.ibcp.fr-/cgi-bin/secpred_sopma.pl，分別將A3G和mA3的序列輸入，采用SOPMA工具對hA3G與mA3的二級結(jié)構(gòu)及各成分所占比例進行預(yù)測。在NCBI數(shù)據(jù)庫https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi，利用Consrved Domain數(shù)據(jù)庫分析hA3G與mA3的結(jié)構(gòu)域。

輸入網(wǎng)址http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index，選擇Phyre2工具，預(yù)測hA3G和mA3的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。

1.2.5 相互作用蛋白分析

輸入網(wǎng)址http://string-db.org/，利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建與hA3G及mA3相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白序列比對分析

hA3G編碼384個氨基酸，mA3編碼396個氨基酸，表1顯示了hA3G與mA3的cov為93%，pid為28.6%。

表1 hA3G與mA3的Clustal Omega比對結(jié)果Table 1 Sequence alignment results of hA3G and mA3 using Clustal Omega %

2.2 理化性質(zhì)分析

通過ExPASy數(shù)據(jù)庫中的在線工具ProtParam，預(yù)測hA3G與mA3蛋白相應(yīng)理化性質(zhì)，見表2。可以看出，hA3G蛋白與mA3 蛋白均為堿性的不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，二者含量最高的氨基酸也都是Leu。

利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtScale在線工具預(yù)測，結(jié)果見表3，hA3G與mA3屬于親水性蛋白質(zhì)(見圖1)。

2.3 蛋白亞細胞定位分析

利用PSORTⅡ分析hA3G與mA3蛋白的亞細胞定位，結(jié)果見表4，可看出hA3G和mA3蛋白均可能定位在細胞質(zhì)、線粒體和細胞核，而最可能的細胞定位是在細胞質(zhì)。

圖1 hA3G與mA3蛋白的親疏水性分析Fig.1 Analysis of hydrophilic and hydrophobic properties of hA3G and mA3

表2 hA3G與mA3的理化性質(zhì)Table 2 Physical and chemical properties of hA3G and mA3%

表3 hA3G和mA3蛋白的親疏水性分析Table 3 Analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of hA3G and mA3

表4 hA3G和mA3蛋白的亞細胞定位Table 4 Subcellular localization of hA3G and mA3 %

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域分析

經(jīng)TMHMM2.0工具預(yù)測結(jié)果如圖2和表5所示，hA3G和mA3均為不跨膜蛋白。紅色細線表示跨膜區(qū)域hA3G和mA3位于膜外(粉色細線)的概率幾乎為100%，位于膜內(nèi)(藍色細線)和跨膜區(qū)域(紅色細線)的概率幾乎為0，粉色粗線代表多肽鏈中跨膜區(qū)域所在位置，因沒有跨膜區(qū)域，所以不顯示相應(yīng)標記。

表5 hA3G與mA3的TMHMM分析結(jié)果Table 5 TMHMM analysis of hA3G and mA3 %

圖2 hA3G和mA3的跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of transmembrane structure of hA3G and mA3

2.5 空間結(jié)構(gòu)分析

利用 SOPMA工具分析hA3G和mA3蛋白的二級結(jié)構(gòu)如圖3，與相應(yīng)二級結(jié)構(gòu)占比見表6。由此可見，hA3G和mA3的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)卷曲，二者的二級結(jié)構(gòu)比例相差不大，結(jié)構(gòu)非常相似。

表6 hA3G和mA3二級結(jié)構(gòu)類型及占比Table 6 Secondary structure types and proportions of hA3G and mA3 %

圖3 hA3G和mA3蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 Secondary structure analysis of hA3G and mA3

通過NCBI的Conserved Domain數(shù)據(jù)庫預(yù)測hA3G和mA3都屬于APOBEC超家族，都具有兩個保守的結(jié)構(gòu)域。APOBEC超家族都包含串聯(lián)的一個或兩個胞嘧啶脫氨酶結(jié)構(gòu)域。APOBEC的C末端結(jié)構(gòu)域(CD2)具有催化活性，而N末端結(jié)構(gòu)域(CD1)不具有使底物脫氨基的能力，即使它們維持核心胞苷脫氨酶折疊，CD1與ssDNA和RNA的結(jié)合可以上調(diào)或下調(diào)相鄰CD2的催化活性[9]。

圖4 hA3G和mA3蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Conserved domain analysis of hA3G and mA3

利用Phyre2工具，進行hA3G和mA3進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖5所示，三維結(jié)構(gòu)中的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖6。hA3G的模板為c2kboA，可信度100%，覆蓋面為50%，一致性為99%；mA3的模板為 c6bwyA，可信度100%，覆蓋面為45%，一致性為36%。

2.6 蛋白質(zhì)相互作用分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫預(yù)測hA3G和mA3的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果如圖7所示。與hA3G相互作用的蛋白質(zhì)包括APOBEC3F(簡稱A3F)、SAMHD1(Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1，簡稱SAMHD1)、BST2(bone marrow stromal antigen 2)、A1CF(APOBEC1 complementation factor，簡稱A1CF)、COX5A(cytochrome c oxidase subunit 5A，簡稱COX5A)、COX5B(cytochrome c oxidase subunit 5B，簡稱COX5B)以及CDA(cytidine deaminase，簡稱CDA)等。hA3F和hA3G屬于A3蛋白質(zhì)，已被確認為有效的抗病毒因子，可限制Vif缺陷的HIV-1復(fù)制[10]。SAMHD1是人類細胞中唯一已知的dNTP酶，含有經(jīng)典的核定位序列(NLS)，抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制[11]。BST-2是一種Ⅰ型干擾素(IFN-I)誘導(dǎo)的細胞蛋白，最初被視為HIV-1釋放的抑制劑，隨后被證明可抑制多種包膜病毒的細胞釋放，在先天抗病毒防御系統(tǒng)中起重要作用[12]。人們一直認為APOBEC1介導(dǎo)的編輯活性依賴于RNA結(jié)合蛋白A1CF，在成人肝臟、小腸或腎臟中正常的C→U編輯不需要A1CF[13]。COX5A是線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV(細胞色素c氧化酶)的核編碼亞基[14]。COX5B是電子傳遞鏈的末端酶，可將電子從還原的細胞色素c轉(zhuǎn)移到氧氣，并且在此過程中，在線粒體內(nèi)膜上產(chǎn)生電化學梯度[15]。CDA是嘧啶補救途徑的酶，可分別通過胞苷和2'-脫氧胞苷的水解脫氨作用催化尿苷和2'-脫氧尿苷的形成[16]。hA3G可能涉及到的生物過程包括病毒生命周期的負調(diào)控(GO:1903901)、病毒防御應(yīng)答(GO:0051607)、胞嘧啶代謝過程(GO:0046087)、堿基轉(zhuǎn)換或替換編輯(GO:0016553)以及胞嘧啶脫氨基(GO:0009972)。hA3G可能具有水解酶活性(GO:0016814)、胞嘧啶脫氨酶活性(GO:0004126)、鋅離子結(jié)合功能(GO:0008270)、細胞色素c氧化酶活性(GO:0004129)以及相同蛋白結(jié)合功能(GO:0042802)。hA3G可能構(gòu)成載脂蛋白BmRNA編輯酶復(fù)合物Ⅳ(GO:0030895)、P-小體(GO:0000932)及線粒體呼吸鏈復(fù)合物(GO:0005751)。hA3G的KEGG通路主要是心肌收縮(hsa04260)、亨廷頓氏病(Huntington’s disease，hsa05016)、帕金森病 (Parkinson’s disease，hsa05012)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，hsa05010)及非酒精性脂肪性肝病(hsa04932)。hA3G的反應(yīng)途徑包括編輯體的形成(HSA-75094)、干擾素信號傳遞(HSA-913531)、TP53調(diào)節(jié)代謝基因(HSA-5628897)及核酸代謝(HSA-15869)等。

與mA3相互作用的蛋白質(zhì)包括A1CF、COX5A、COX5B、APOBEC1、APOBEC2、Gm11273(一種細胞色素C氧化酶)、細胞色素C1(cytochrome c1，簡稱Cyc1)以及Uqcrfs1(ubiquinol-cytochrome c reductase, Rieske iron-sulfur polypeptide 1，簡稱Uqcrfs1)等。Uqcrfs1是線粒體呼吸鏈細胞色素bc1復(fù)合物的關(guān)鍵亞基，產(chǎn)生與ATP合成偶聯(lián)的電化學勢，以將電子從泛醇轉(zhuǎn)移至細胞色素c[17]。mA3涉及到的生物過程包括C→U編輯(GO:0016554)、胞嘧啶代謝過程(GO:0046087)、胞嘧啶脫氨基(GO:0009972)、含核堿基的小分子代謝過程(GO:0055086)及mRNA修飾(GO:0016556)。mA3可能具有水解酶活性(GO:0016814)、脫氨酶活性(GO:0019239)、胞嘧啶脫氨酶活性(GO:0004126)、鋅離子結(jié)合功能(GO:0008270)、電子轉(zhuǎn)移功能(GO:0009055)以及結(jié)合金屬離子的功能(GO:0046872)。mA3可參與構(gòu)成細胞色素復(fù)合物(GO:0070069)、呼吸鏈復(fù)合體(GO:0098803)、線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ(GO:0005751)及線粒體內(nèi)膜蛋白復(fù)合物(GO:0098800)。mA3的KEGG通路主要是心肌收縮(mmu04260)、帕金森病 (Parkinson’s disease，mmu05012)、非酒精性脂肪性肝病(mmu04932)、氧化磷酸化(mmu00190)以及阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，mmu05010)。mA3參與的反應(yīng)途徑有編輯體的形成(MMU-75094)。

圖5 hA3G和mA3蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.5 Three-dimensional structure of hA3G and mA3

圖6 hA3G和mA3蛋白三維結(jié)構(gòu)下的二級結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of hA3G and mA3 in three-dimensional model

圖7 與hA3G和mA3相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Protein network interacting with hA3G and mA3

3 討 論

mA3是胞苷脫氨酶，其可作用于逆轉(zhuǎn)錄病毒的單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄物，導(dǎo)致前病毒DNA的G→A超突變，其對Vif缺陷HIV-1的限制與hA3G一樣強大[3,18]。通過序列比對發(fā)現(xiàn)hA3G編碼384個氨基酸，mA3編碼396個氨基酸，hA3G與mA3的cov為93%，pid為28.6%。本文利用ExPASy數(shù)據(jù)庫中的ProtParam和ProtScale在線工具預(yù)測hA3G和mA3均為堿性的不穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)，二者含量最高的氨基酸也都是Leu。PSORTⅡ分析hA3G和mA3定位于細胞質(zhì)。TMHMM2.0工具預(yù)測hA3G和mA3為不跨膜蛋白。

hA3G和mA3的二級結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)卷曲，屬于APOBEC超家族，具有兩個保守的結(jié)構(gòu)域。已有研究顯示hA3G C末端結(jié)構(gòu)域具有脫氨酶活性，N-末端結(jié)構(gòu)域是進入病毒粒子所必需的，mA3C末端結(jié)構(gòu)域是進入病毒粒子所必需的，而N-末端結(jié)構(gòu)域具有胞苷脫氨酶活性[3]。

利用STRING數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)與hA3G相互作用的蛋白質(zhì)包括A3F、SAMHD1、BST2、A1CF、COX5A、COX5B。hA3G可能參與病毒生命周期的負調(diào)控、病毒防御應(yīng)答、胞嘧啶代謝過程、堿基轉(zhuǎn)換或替換編輯以及胞嘧啶脫氨基。與mA3相互作用的蛋白質(zhì)包括A1CF、COX5A、COX5B、APOBEC1、APOBEC2、Gm11273、Cyc1以及Uqcrfs1等。mA3涉及到的生物過程包括C→U編輯、胞嘧啶代謝過程、胞嘧啶脫氨基、含核堿基的小分子代謝過程及mRNA修飾。hA3G和mA3具有水解酶活性和脫氨酶活性，具有鋅離子結(jié)合功能?？梢钥闯?，與hA3G和mA3均相互作用的蛋白有A1CF、COX5A和COX5B；二者都可構(gòu)成線粒體復(fù)合物，KEGG通路都是心肌收縮、帕金森病以及阿爾茨海默病。

哺乳動物APOBEC3蛋白是體內(nèi)限制慢病毒的重要因子。為了克服APOBEC3介導(dǎo)的抗病毒作用，慢病毒在進化上獲得了輔助蛋白——病毒感染因子Vif，而Vif通過泛素/蛋白酶體依賴性途徑降解宿主APOBEC3蛋白。盡管Vif-APOBEC3相互作用及其進化意義已得到很好的研究，特別是靈長類動物慢病毒(包括HIV)和靈長類動物(包括人類)的相互作用，但對非靈長類慢病毒和非靈長類動物的研究很少。

嚙齒動物僅編碼一個APOBEC3家族成員，大鼠和小鼠均為APOBEC3Z2Z3基因融合并且缺失APOBEC3Z1基因[19-20]。mA3限制ΔVifHIV-1的能力與hA3G相似，并且在ΔVifHIV-1中誘導(dǎo)了非常高水平的G→A突變。mA3與hA3G的結(jié)構(gòu)分析可能對進一步揭示哺乳動物APOBEC3的功能及其在治療艾滋病和癌癥等疾病中的作用有重要意義。