基于生物信息學(xué)篩選染料木素抗骨肉瘤靶基因

郭良煜，余 鈴，陳敬騰，龔長天，施玉博，郭衛(wèi)春

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 骨科， 武漢 430060)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是來源于骨組織的惡性腫瘤，多見于青少年和兒童，發(fā)生部位在長骨遠(yuǎn)端，在早期就容易產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲[1-2]。大約15%～20%的患者在早期就診時可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。肺是最常見的轉(zhuǎn)移部位，占轉(zhuǎn)移疾病的85%以上，而骨骼是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的第二常見部位。近幾年來化療藥物的使用雖然提高了骨肉瘤患者的生存率和生活質(zhì)量，但患者對化療藥物產(chǎn)生的耐藥性和較高的毒副作用仍然是難解決的問題[3]。 因此，急需新的藥物進(jìn)行治療。

染料木素(Genistein)是一種天然存在于水果、堅果和大豆中的物質(zhì)，前期的許多研究表明了它能有效的抑制乳腺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌，腦癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤和慢性淋巴細(xì)胞白血病的活性[4]。同時染料木素也能夠通過抑制炎癥、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)類固醇激素受體和代謝途徑等方面來降低腫瘤細(xì)胞的活性和數(shù)量[5]。染料木素的抗腫瘤能力在許多癌癥中都得等到了體現(xiàn)，但在骨肉瘤的研究中卻很少見。

近幾年來開始使用生物信息學(xué)的方法來篩選藥物可能作用的靶基因，在通過靶基因與腫瘤之間的關(guān)系來評價藥物對腫瘤是否有作用，例如利用生物信息學(xué)預(yù)測白黎蘆醇作用于前列腺癌的靶基因[6]；用生物信息學(xué)方法來篩選對乳腺癌治療有用的藥物和它們的靶基因[7]。本研究在DrugBank 數(shù)據(jù)庫篩選染料木素作用的靶基因。經(jīng)過一系列方法篩選出CXCL8,CXCL12,LPAR1和CNR1；hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p和hsa-miR-200a-3p作為染料木素在骨肉瘤中最重要的靶基因，對于靶向治療的前景具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 選擇藥物相關(guān)的靶基因

DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)是一個全面的、可以免費訪問的、包含藥物和藥物靶基因的在線數(shù)據(jù)庫。它是生物信息學(xué)和化學(xué)信息學(xué)的詳細(xì)來源，它將藥物數(shù)據(jù)和藥物靶標(biāo)的信息相結(jié)合，它總共包含13 494種藥物，其中包括2 638種已經(jīng)批準(zhǔn)的小分子藥物，1 367種批準(zhǔn)的生物制劑(蛋白質(zhì)，多肽，疫苗和能引起過敏的過敏原)，131種營養(yǎng)藥品和至少6 347種正進(jìn)行實驗的藥物[8]。用DrugBank用于搜索與染料木素相關(guān)的靶基因。

1.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵基因

String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)是構(gòu)建蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的常用數(shù)據(jù)庫，同時可以預(yù)測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，將基因上傳至String數(shù)據(jù)庫，從而構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)圖[9]。Cytoscape軟件是一款可以將PPI可視化的軟件，并且具有多種功能強大的插件，可以繼續(xù)對PPI進(jìn)行后續(xù)的分析和編輯。將與染料木素有關(guān)的基因?qū)氲絪tring數(shù)據(jù)庫中，單個基因連接數(shù)不超過35個同時基因與基因之間的關(guān)聯(lián)最低為0.7。隨后將string數(shù)據(jù)庫中得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape(http://www.cytoscape.org/)中得到PPI圖。隨后用插件CytoHubba來對PPI網(wǎng)路進(jìn)行相互作用分析，篩選出排名前25的關(guān)鍵基因。

1.3 Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)分析

WebGestalt (http://www.webgestalt.org)和DAVID數(shù)據(jù)庫相似，是一個全面的進(jìn)行GO和KEGG功能分析的網(wǎng)站[10]，更新比DAVID及時。將25個關(guān)鍵基因?qū)氲絎ebGestalt數(shù)據(jù)庫中，以P<0.05為基準(zhǔn)篩選信號通路，最終選出10個基因信號通路。

1.4 數(shù)據(jù)庫驗證關(guān)鍵靶基因

HCMDB (Human Cancer Database)是一個用于存儲和分析腫瘤的數(shù)據(jù)庫。從GEO和TCGA中收集了124個以前發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集。它包含了29種癌癥類型。將得到的關(guān)鍵靶基因輸入HCMDB中進(jìn)行驗證。

1.5 預(yù)測靶基因的miRNA和驗證

將驗證后的靶基因輸入到miRDB數(shù)據(jù)庫中，miRDB數(shù)據(jù)庫是可以進(jìn)行mRNA和miRNA預(yù)測的數(shù)據(jù)庫，篩選條件為target score≥80。隨后將得到的miRNA在GSE65071數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行驗證。

2 結(jié)果分析

2.1 與染料木素相關(guān)的靶基因

表1詳細(xì)展示了染料木素在DrugBank里的信息，是屬于小分子物質(zhì)，分子量為270.236 9，同時它可以抑制蛋白酪氨酸激酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶-II(DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，II型)的活性，所以可以作為抗腫瘤的藥物。在實驗上，它已經(jīng)顯示出在人和鼠細(xì)胞系中可以誘導(dǎo)G2期停滯，而阻滯細(xì)胞周期也是誘導(dǎo)凋亡的一個重要途徑，目前正在進(jìn)行前列腺癌的研究，表2展現(xiàn)出了與染料木素有關(guān)的13個基因，分別是ESR2,TOP2A,PTK2B,NCOA1,ESR1,NCOA2,ESRRA,ESRRB,NR1I2,AKT1,GPER1,CYP1B1和SHBG，在其中選擇對基因作用仍不是很明確的靶基因，因此，最終選出11個與染料木素有關(guān)的靶基因。

2.2 染料蘇木靶基因PPI圖和相關(guān)基因

將所選取的11個靶基因?qū)雜tring數(shù)據(jù)庫中，隨后刪除重復(fù)的蛋白，得到了284個與11個靶基因有關(guān)的基因(見圖1a)，用Cytoscape插件中的CytoHubba來分析，得出在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中排名前25的基因，這25個基因就是關(guān)鍵基因(見圖1b)，分別為CXCL8，GRM4，GPER1，OPRK1，GRM7，OPRD1，SST，GRM3，LPAR1，CXCL12，GRM8，CASR，GPR37，GPR17，GPR18，GRM6，CNR1，DRD2，APP，BDKRB2，KNG1，OPRL1，PNOC，DRD3，AGT。

表1 染料木素在DrugBank里的信息Table 1 Information on genistein in DrugBank

圖1 PPI圖和25個關(guān)鍵基因Fig. 1 PPI network and 25 key genes

表2 染料木素的靶基因信息Table 2 Target gene information of genistein

2.3 KEGG分析

將25個關(guān)鍵基因?qū)氲絎ebGestalt中，以P<0.05為基準(zhǔn)篩選出信號通路，最終得到了10個與關(guān)鍵基因有關(guān)的信號通路(見圖2)，分別為神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Pvalue為7.016 609 515 630 98×10-14)；磷脂酶D信號通路(Pvalue為1.259 889 412 796 86×10-7)；谷氨酸能突觸(Pvalue為1.623 606 752 154 67×10-5)；可卡因成癮(Pvalue為8.957 925 689 391 24×10-3)；Rap1信號通路(Pvalue為2.163 675 640 824 39×10-2)；補體途徑(Pvalue為2.225 309 023 143 79×10-2)；肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)(Pvalue為2.361 391 695 821 74×10-2)；細(xì)胞間隙連接(Pvalue為2.721 187 625 285 12×10-2)；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Pvalue為2.836 966 674 350 58×10-2)；NF-kappa B信號通路(Pvalue為3.135 002 865 670 41×10-2)(見表3)。在這些通路中，NF-kappa B和Rap1信號通路在骨肉瘤中研究較多，例如骨肉瘤差異基因的分析也證實了差異基因主要存在于Rap1信號通路[12]，同時也有文獻(xiàn)證實了類黃酮B可以通過抑制NF-kappa B信號通路從而使得骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性提高[13]。因此，選取這兩個信息通路所在的基因，進(jìn)行下一步的分析。

圖2 KEGG富集分析結(jié)果Fig.2 Results of KEGG enrichment analysis

2.4 驗證靶基因

將最后得到的5個靶基因輸入HCMDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行驗證，最后發(fā)現(xiàn)4個基因在骨肉瘤中具有統(tǒng)計學(xué)差異，分別是CXCL8,CXCL12,LPAR1和CNR1(見圖3)。

表3 KEGG富集分析結(jié)果Table 3 Results of KEGG enrichment analysis

圖3 CXCL8, CXCL12, LPAR1和CNR1數(shù)據(jù)庫驗證(*P<0.05)Fig. 3 Verification of CXCL8, CXCL12, LPAR1, and CNR1 in database(*P<0.05)

2.5 預(yù)測靶基因的miRNA和數(shù)據(jù)庫驗證

將驗證后的4個靶基因利用miRDB進(jìn)行miRNA預(yù)測，篩選標(biāo)準(zhǔn)為與靶基因的target score≥80，得到了mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。其中選取與4個靶基因關(guān)聯(lián)程度高的5個miRNA：hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p和has-miR-4524a-3p。隨后將5個miRNA用GSE65071進(jìn)行驗證，最后得到4個miRNA：hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p(見圖5)。

圖4 mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Regulation network diagram of mRNA-miRNA

圖5 hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p在GSE65071驗證(*P<0.05)Fig. 5 Verification of hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-23a-3p, and hsa-miR-141-3p, hsa-miR-200a-3p in GSE65071(*P<0.05)

3 討 論

骨肉瘤惡性程度較高，發(fā)病率較低但死亡率較高。當(dāng)前的治療主要以手術(shù)切除加術(shù)前術(shù)后放化療為金標(biāo)準(zhǔn)，但治療效果往往不佳，主要是因為患者的耐受和化療藥物嚴(yán)重的毒副作用[3]。染料木素是一種天然的小分子物質(zhì)，在前期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)染料木素可以抑制多種腫瘤的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過生物信息學(xué)的方法來分析染料木素調(diào)控骨肉瘤可能的信號通路和可能的靶基因，為后續(xù)的基礎(chǔ)實驗提供理論依據(jù)。

首先在DrugBank數(shù)據(jù)庫中選取與染料蘇木有關(guān)的靶基因，后將與染料蘇木有關(guān)的靶基因?qū)氲絪tring數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析，用Cytoscape中的插件Cytohubb進(jìn)行分析，獲得排名前25的關(guān)鍵基因。隨后將這個25個基因?qū)氲絎ebGestalt數(shù)據(jù)庫中篩選與骨肉瘤相關(guān)的通路，將通路中的基因?qū)際CMDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行驗證，確認(rèn)了4個靶基因：CXCL8,CXCL12,LPAR1,CNR1。最后預(yù)測4個靶基因的miRNA并進(jìn)行驗證，得到4個miRNA：hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p。

以上4個靶基因都與骨肉瘤之間有關(guān)，前期研究報道了CXCL8通過調(diào)節(jié)PI3K / Akt信號通路促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]；而 CXCL12/ CXCR4軸在骨肉瘤原發(fā)性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中存在重要的作用，特別是肺轉(zhuǎn)移[15]。研究發(fā)現(xiàn)單?；视椭久敢种苿㎎ZL184可以抑制骨肉瘤所造成的骨溶解現(xiàn)象，可能是通過調(diào)控CNR1進(jìn)行的[16]。而用順鉑處理后的骨肉瘤MG63細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)LPAR1的表達(dá)明顯減低，證實LAPR1也和骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[17]。miR-23b-3p可以通過抑制PGC1α從而促進(jìn)骨肉瘤增殖從[18]；miR-141-3p是骨肉瘤中 EGFR通路的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展[19]；另外兩種miRNA雖與骨肉瘤無直接相關(guān)，但這兩種miRNA在骨肉瘤中表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)差異，且兩種miRNA可調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展[20-21]。因此，以上分析中所得到的4個靶基因和4個miRNA都與骨腫瘤有著聯(lián)系，可以作為骨肉瘤潛在的靶基因。為以后對骨肉瘤的基礎(chǔ)實驗提供了理論依據(jù)，同時也為染料木素治療骨肉瘤增加了靶基因并且提供了理論支持。

4 結(jié) 論

通過對染料木素中11個靶基因有關(guān)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探討染料木素對骨肉瘤潛在的作用靶基因。運用STRING、WebGestalt，cytoscape和HCDMB以及miRDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CXCL8,CXCL12,LPAR1,CNR1以及hsa-miR-23b-3p，hsa-miR-23a-3p，hsa-miR-141-3p，hsa-miR-200a-3p基因可能是骨肉瘤的潛在靶基因。不僅能促進(jìn)骨肉瘤研究的進(jìn)展，也可以老藥新用，提供新的藥物治療靶點，進(jìn)而擴大藥物的適用范圍。