高效液相色譜-二極管陣列檢測法測定小麥粉及面粉改良劑中福美雙

王許欣, 周澍堃, 李曉敏, 張慶合

(中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所, 北京 100029)

福美雙(thiram)是重要的二硫代氨基甲酸酯(DTC)殺菌劑,DTC包括二甲基二硫代氨基甲酸酯(DMDs)、乙撐二硫代氨基甲酸酯(EBDs)和丙撐二硫代氨基甲酸酯(PBDs)[1]。福美雙是二甲基二硫代氨基甲酸的氧化產物,是一種無金屬殺菌劑。福美雙可用作種子保護劑,用于水果、蔬菜、觀賞植物和草坪作物的葉面處理,以控制真菌病害的數(shù)量,并保護收獲的作物在儲存或運輸過程中不變質[2]。美國環(huán)境保護署法規(guī)(EPA-HQ-OPP-2009-0431-0001)和歐盟(EC) No 396/2005(《歐盟植物源和動物源食品及飼料中的農藥最大殘留限量》)均對福美雙進行了限量規(guī)定,涉及食品基體主要是水果和蔬菜,限量范圍為0.1～15 mg/kg,對谷物沒有給出明確的限量。按照國家標準GB 2763-2019,小麥中福美雙殘留物以二硫化碳(CS2)表示,最大殘留量為1 mg/kg,折算成福美雙含量約為1.5 mg/kg。目前我國相關的檢測方法是針對二硫代氨基甲酸酯一類的化合物,無法特異性的實現(xiàn)對福美雙的檢測,因此開展小麥粉中福美雙檢測方法的研究有重要意義。

目前,文獻報道蔬菜、水果、土壤等中福美雙通過轉換、提取、凈化等前處理后,采用光譜法[3]、氣相色譜法(GC)[4,5]、高效液相色譜法(HPLC)[6-8]和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(HPLC-MS/MS)[1,2,9-13]等方法檢測。二硫代氨基甲酸酯易受pH值、基質成分和溫度的影響,在樣品前處理過程中容易降解[2],所以傳統(tǒng)檢測方法將二硫代氨基甲酸酯與酸反應生成CS2,通過分光光度法或氣相色譜法(GC)等技術測定CS2含量,間接計算二硫代氨基甲酸酯的總量[4,14]。但這類方法耗時,靈敏度低,且無法直接得到福美雙的含量。福美雙在堿性緩沖水溶液中,定量轉化為DMD陰離子,通過HPLC-UV[6]或LC-MS測定DMD,間接實現(xiàn)福美雙含量的測定[10]。福美鋅在堿性條件下也降解為DMD陰離子,產生假陽性信號,這導致福美雙檢測結果的準確性低[14]。有研究證明,二硫代氨基甲酸酯在亞硫酸鹽存在的情況下,僅福美雙定量轉化為DMD-亞硫酸鹽加合物,因此DMD-亞硫酸鹽加合物可作為福美雙檢測的標志物[1]。文獻也有通過二氯甲烷、氯仿、己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯或甲醇等有機溶劑從蔬菜、水果基體中提取福美雙,經固相萃取等凈化后,采用HPLC、HPLC-MS/MS直接檢測[15,16]。目前在小麥粉及面粉改良劑中檢測福美雙的文獻較少,以上方法無論從基體適用性還是方法特異性,都不能滿足小麥粉及面粉改良劑中福美雙的定量檢測。

本研究采用乙腈直接溶劑提取,經振蕩、超聲等操作后使用液相色譜法檢測小麥粉及面粉改良劑中的福美雙。通過對提取方式、色譜條件及溶液穩(wěn)定性等因素的優(yōu)化和評估,建立了準確檢測小麥粉及面粉改良劑中福美雙的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD XR液相色譜儀,配有DAD二極管陣列檢測器(日本島津公司); xp205型電子天平(精度為0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Vortex-Genie 2型渦旋混合器(美國Scientific Industries公司); KQ 3000 VDV型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); IKA HS 260 Basic型往復式振蕩搖床(德國IKA公司); Milli-Q型超純水發(fā)生器(美國Millipore公司);娃哈哈純凈水(娃哈哈有限公司);聚丙烯(GHP)有機濾膜(孔徑0.22 μm)。

乙腈、甲醇、正己烷、丙酮(色譜級,德國Merck公司);二氯甲烷(色譜級,中國克萊曼公司);四氫呋喃(色譜級,美國Sigma-Aldrich公司);福美雙標準品(CAS號:137-26-8,德國Dr. Ehrenstorfer公司)。小麥粉、面粉改良劑均為市售。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取福美雙標準品10 mg(精確至0.01 mg),置于100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,充分搖勻,配制成100 μg/mL的標準儲備液,于4 ℃冷藏保存。

分別準確移取0.15、0.5、1.5、5.0和15 mL的標準儲備液,置于50 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混勻,配制質量濃度為0.3、1.0、3.0、10和30 μg/mL的系列標準工作液,于4 ℃冷藏保存。

1.3 樣品前處理

取小麥粉或面粉改良劑代表性樣品約100 g,混勻,裝入潔凈容器中,干燥避光保存。

稱取1 g試樣(精確到0.01 g),置于50 mL具塞塑料離心管中,加入乙腈5 mL,渦旋1 min,振蕩15 min后,冰水浴超聲10 min,靜置2 min(如渾濁,以6 000 r/min高速離心2 min),取上清液,過0.22 μm有機相濾膜,供測定。

1.4 分析條件

色譜柱:ZORBAX plus-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:25 ℃;流動相:(A)水和(B)乙腈;流速:1.5 mL/min。梯度洗脫程序:0.1～5.0 min, 50%B; 5.0～5.5 min, 50%B～90%B; 5.5～6.5 min, 90%B; 6.5～7.0 min, 90%B ～ 50%B; 7.0～10.0 min, 50%B。流速:1.5 mL/min。進樣量:20 μL;檢測波長:280 nm。

2 結果與討論

2.1 溶解液的選擇

分別采用異丙醇、甲醇、丙酮、乙腈配制福美雙母液。結果表明,丙酮的溶解性最佳;乙腈配制后經充分振蕩后溶解;異丙醇、甲醇需充分振蕩和超聲后溶解。丙酮色譜吸收截止波長為330 nm,容易對分析物造成干擾,因此采用乙腈制備母液。

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1提取溶劑優(yōu)化

福美雙的極性較弱,正辛醇/水分配系數(shù)的對數(shù)(logKow)為1.73,不溶于水,可溶于乙腈、丙酮、二氯甲烷和氯仿等有機試劑。因此,實驗采用1 g樣品,比較了8 mL的正己烷、二氯甲烷、四氫呋喃、丙酮、乙腈、甲醇等溶劑的提取效果(見圖1)。采用正己烷提取時,提取回收率為0;采用四氫呋喃、二氯甲烷和甲醇時,回收率分別為52%～60%、52%～62%和4%～6%;采用丙酮時,回收率為75%～85%,但由于溶劑效應,福美雙峰形較差;采用乙腈時,提取回收率為86%～94%。Ekroth等[17]采用乙酸乙酯和環(huán)己烷的混合物提取果蔬中福美雙,樣品平均回收率為40%～86%。Dinesh等[7]采用反相高效液相色譜法測定芒果和石榴中福美雙等多種農藥,樣品前處理采用乙腈提取和PSA分散固相萃取,平均回收率分別大于87%和96%。江澤軍等[18]采用樣品經乙腈提取,PSA、C18吸附劑凈化,水稻植株或稻殼中福美雙的回收率為76%～99%。因此,福美雙的提取效率與基體有較大的相關性,針對小麥粉及面粉改良劑,選擇乙腈作為提取溶劑。

圖 1 不同提取溶劑對福美雙回收率的影響(n=3)Fig. 1 Effects of different extraction solvents on the recoveries of thiram (n=3)

當樣品加標水平為15 mg/kg,比較了1 g樣品采用8 mL和5 mL乙腈提取時,福美雙的回收率均為85%～110%,最終選用5 mL乙腈提取,滿足靈敏度且節(jié)約溶劑。同時,比較了1 g樣品5 mL乙腈提取和2 g樣品10 mL乙腈提取,前者的回收率為100.8%, RSD為2.6%,后者回收率為95%, RSD為1.7%,兩者沒有明顯差異。因此,采用1 g樣品5 mL乙腈提取的前處理條件。

2.2.2振蕩、超聲條件優(yōu)化

實驗比較了振蕩與超聲條件的影響。在加標水平為7.5 mg/kg和15 mg/kg時,振蕩15 min,福美雙的回收率均為85%～95%,振蕩25 min時,回收率均為89%～100%。冰水浴超聲10 min和15 min的條件,福美雙的回收率均為92%～97%,沒有明顯差異。最終選擇振蕩15 min和冰水浴超聲10 min的前處理條件。

2.3 液相色譜條件優(yōu)化

2.3.1色譜柱的選擇

福美雙分析主要有直接分析法和轉化產物的間接分析法。福美雙為弱極性化合物,直接法主要采用C18色譜柱[2,12]分析。間接法是在堿性條件下將福美雙轉化為DMD陰離子,采用親水相互作用色譜柱(HILIC柱)檢測[19]。

本實驗比較了HILIC和Amide兩種色譜柱直接檢測福美雙,結果顯示福美雙沒有保留。另外本方法比較了BEH-C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、ZORBAX plus-C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm)和UNITARY C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱的分離情況。結果顯示,3種色譜柱均能有效保留福美雙。BEH-C18是超高效液相色譜柱,成本偏高,普適性不強;采用ZORBAX plus-C18色譜柱時,福美雙的峰形較采用UNITARY C18色譜柱時對稱性好,峰寬窄。因此,最終本研究采用ZORBAX plus-C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱。

2.3.2檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在200～400 nm掃描范圍內,得到福美雙的紫外吸收光譜圖(見圖2)。福美雙在220、254和280 nm均有較強吸收,由于220 nm處溶劑干擾較大,因此比較福美雙在254 nm和280 nm的檢測特異性。在254 nm處,加標3.0 mg/kg時小麥粉(見圖3a)和面粉改良劑(見圖3b)基質干擾大于280 nm,不利于福美雙的定量。因此選用280 nm為檢測波長。

圖 2 福美雙的紫外吸收光譜圖Fig. 2 UV absorption spectrum of thiram

圖 3 加標(a)小麥粉和(b)面粉改良劑中福美雙(3.0 mg/kg)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of thiram (3.0 mg/kg) spiked in (a) wheat flour and (b) flour improvers

2.3.3流動相的選擇

福美雙在堿性條件下生成DMD陰離子,在酸性條件下生成鹽[20],因此本研究不考慮添加酸或者緩沖體系,僅選擇有機溶劑與水的分離條件。實驗比較了水-甲醇和水-乙腈兩種流動相體系。流動相為水-甲醇體系時,福美雙無法與干擾成分有效分離(見圖4a),因此考察水-乙腈體系。

采用水-乙腈梯度洗脫,雜質與福美雙得到有效分離(見圖4b),但是基線逐漸上升?？紤]到低濃度檢測的靈敏度,改變流動相梯度,福美雙無干擾且基線穩(wěn)定性得到改善(見圖4c)。因此采用水-乙腈作為最終分離體系。Zhou等[21]采用C18色譜柱,流動相為乙腈-水(50∶50, v/v),能夠完全分離食品樣品中的福美雙與其他物質。江澤軍等[18]在水中添加了0.2%甲酸,并比較了甲醇-水和乙腈-水兩種流動相體系,結果顯示流動相為甲醇-水時,色譜柱壓力較高,且基線噪聲較大。

2.4 方法學驗證

2.4.1福美鋅干擾分析

福美雙和福美鋅結構相似,且紫外光譜類似[1],因此開展了福美鋅干擾實驗研究。比較了在小麥粉樣品中分別添加10 mg/kg福美鋅以及10 mg/kg福美鋅、10 mg/kg福美雙。結果顯示,僅添加福美鋅時,在福美雙的色譜保留時間內沒有色譜峰;同時添加福美鋅和福美雙時,福美雙的回收率為92%～95%,說明福美鋅的存在不干擾福美雙的測定。

2.4.2基質效應

文獻中土壤和糙米對福美雙具有基質抑制,應采用基質匹配校準溶液[18],植株、稻殼、豆芽均無明顯基質效應,可用溶劑校準溶液,采用外標法進行定量[22]。說明基質效應與基體密切相關,因此本方法比較了0.3、1.0和3.0 μg/mL由空白小麥粉經整個前處理過程得到的基質校準溶液和純乙腈溶液的響應差異。結果顯示,二者的響應沒有差異,證明基質影響不顯著。因此,直接采用溶劑配制標準溶液進行外標法定量。

2.4.3線性范圍、檢出限和定量限

在0.30～30 μg/mL線性范圍內,以福美雙的質量濃度為橫坐標(x, μg/mL)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線,得到線性回歸方程為y=38.13x,相關系數(shù)(r2)為0.999 99。

選擇空白樣品,定量添加標準溶液,當所得譜圖的信噪比為3和10時,將添加量定義為檢出限和定量限分別為0.5 mg/kg和1.5 mg/kg。果蔬等食品基質中福美雙的定量限范圍一般為0.01～2.5 mg/kg[11,17,21-23]。與文獻相比,本研究采用直接檢測,操作簡單,靈敏度滿足標準限量,可用于福美雙的檢測。

圖 4 采用不同流動相和梯度洗脫程序時空白及加標樣品的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the blank and spiked samples by different mobile phases and gradient elution programs a. mobile phases: (A) water and (B) methanol; gradient elution program: 0-0.1 min, 40%B, 0.1-6.5 min, 40%B-90%B, 6.5-7.5 min, 90%B, 7.5-8.5 min, 90%B-40%B, 8.5-10 min, 40%B; b. mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution program: 0-0.1 min, 25%B, 0.1-6.5 min, 25%B-80%B, 6.5-7.5 min, 80%B-95%B, 7.5-8.5 min, 95%B-25%B, 8.5-10 min, 25% B; c. mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; 0-5 min, 50%B; 5-5.5 min, 50%B-90%B; 5.5-6.5 min, 90%B; 6.5-7.0 min, 90%B-50%B; 7.0-10 min, 50%B.

2.4.4回收率與精密度

對一種小麥粉和兩種面粉改良劑進行添加回收實驗,添加水平分別為1.5、3.0和15 mg/kg。結果表明,福美雙的平均加標回收率為89.6%～98.3%,相對標準偏差為1.6%～3.9%(n=6),方法精密度良好(見表1)。曹秀等[24]采用甲醇超聲提取,超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定小麥粉中福美雙殘留量,加標回收率為70.52%～85.20%,相對標準偏差為8.74%～9.42%。結果顯示,本研究方法有較高的回收率與精密度。

表 1 小麥粉及面粉改良劑中福美雙的加標回收率和精密度(n=6)

2.5 穩(wěn)定性

2.5.1標準儲備液穩(wěn)定性

將福美雙標準儲備液(1.0 mg/mL)在4 ℃條件下棕色瓶密封保存,然后分別在1、2、14、21 d取出,稀釋制成0.3、1.0、10.0 μg/mL的標準溶液,并將其與新制備的標準儲備溶液比較。結果顯示,儲備液4 ℃放置21 d,福美雙的峰面積與新配制的無顯著性差異。因此,儲備液4 ℃放置21 d穩(wěn)定性良好。

2.5.2系列標準溶液

將配制好的系列標準溶液(0.3、1.0、3.0、10.0和30.0 μg/mL)在4 ℃條件下棕色瓶密封保存,在一定時間后(2 d和14 d)取出測定。結果顯示,0、2、14 d的系列標準溶液峰面積基本一致。因此,系列校準溶液在4 ℃冷藏避光下至少可以穩(wěn)定保存14 d。

2.5.3標準溶液的短期穩(wěn)定性

取3 μg/mL福美雙標準溶液置于棕色瓶中,分別考察室溫光照4 h和室溫避光48 h內福美雙峰面積變化情況。福美雙響應的相對標準偏差分別為1.5%和0.7%?？梢姼Ｃ离p在乙腈溶液中較為穩(wěn)定。

2.5.4提取溶液的穩(wěn)定性

在一種小麥粉樣品、3種小麥粉改良劑樣品中分別添加10 mg/kg福美雙,將處理好的樣品在5、12、24、36 h內連續(xù)進樣,福美雙在小麥粉和兩種小麥粉改良劑中的響應變化均小于10.0%,而在一種小麥粉改良劑中的福美雙響應下降50%。因此需要考慮提取液的穩(wěn)定性,建議處理完12 h內上機測定。

3 結論

本文采用乙腈提取,HPLC-DAD直接測定小麥粉及面粉改良劑中福美雙的方法。該方法操作簡單,精密度高,靈敏度好,設備成本低,適用于實際大量檢測使用。