內(nèi)源性一氧化碳呼氣試驗(yàn)檢測(cè)高原紅細(xì)胞增多癥患者紅細(xì)胞壽命

普布旺堆 方 潔 羅布卓瑪 巴頓 許彭鵬 鄭 宇 李軍民 李嘯揚(yáng)

高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia，HAPC)是由于高原低氧環(huán)境引起的機(jī)體紅細(xì)胞過(guò)度代償性增生的一種慢性高原病。與同海拔高度的健康人相比，HAPC患者以紅細(xì)胞、血紅蛋白、血細(xì)胞比容顯著增高，動(dòng)脈血氧飽和度降低為主要特征[1]。根據(jù)2004 年第6屆高原醫(yī)學(xué)國(guó)際會(huì)議的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于長(zhǎng)期居住于海拔>2 500 m的居民，血紅蛋白男性>210 g/L，女性>190 g/L者應(yīng)考慮為HAPC[2]。我國(guó)西藏地區(qū)平均海拔>4 000 m，該地區(qū) HAPC 患病率約為3%～5%[3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì) HAPC的發(fā)病機(jī)制、流行病學(xué)、治療手段等進(jìn)行了廣泛研究，以期減少HAPC發(fā)生，改善患者預(yù)后。本研究采用快速內(nèi)源性一氧化碳(CO)呼氣試驗(yàn)檢測(cè)HAPC患者的紅細(xì)胞壽命，以探討HAPC發(fā)生的病理學(xué)機(jī)制和紅細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)的改變。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2020年4—9月由日喀則市人民醫(yī)院血液科收治并確診的50例HAPC患者。所有入選患者經(jīng)仔細(xì)詢問(wèn)病史、體格檢查，完善外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)和涂片分類(lèi)，肝、腎功能，動(dòng)脈血?dú)夥治?，JAK2基因、CALR基因、MPL基因、BCR-ABL融合基因的定性檢測(cè)等檢查，排除真性紅細(xì)胞增多癥和繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥，均符合HAPC診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。正常對(duì)照組10例，均為健康志愿者；既往無(wú)慢性病史，體格檢查未發(fā)現(xiàn)異常體征，血常規(guī)、肝腎功能、心肺功能等檢查結(jié)果均無(wú)異常，且在納入研究之前至少4周內(nèi)無(wú)急性疾病史、用藥史、吸煙史。本項(xiàng)目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核和批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為2020RSYLL1001)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 紅細(xì)胞壽命測(cè)定 采用內(nèi)源性CO呼氣試驗(yàn)檢測(cè)紅細(xì)胞壽命[4]，檢測(cè)設(shè)備為深圳先亞生物科技有限公司生產(chǎn)的RBCS-01型紅細(xì)胞壽命測(cè)定儀。采氣前24 h內(nèi)禁止吸煙，清晨起床后受檢者保持空腹、靜息狀態(tài)，采氣時(shí)間限定在上午9：00-12：00。采氣時(shí)受檢者首先深吸氣，屏氣10 s以上，隨之口含密封鋁箔肺泡氣收集袋的單向?qū)夤懿⑸詈魵?，去除呼吸道死腔氣體后，收集呼出氣；同時(shí)，應(yīng)用手動(dòng)氣泵采集同室空氣樣本。2份氣樣同時(shí)送檢，上機(jī)測(cè)定CO濃度[5]。儀器操作嚴(yán)格按照使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 紅細(xì)胞單采術(shù) 應(yīng)用COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)(美國(guó)泰爾茂比司特公司)進(jìn)行紅細(xì)胞單采術(shù)。全血處理量約為1 000～1 500 mL，全血流速為40～60 mL/min，復(fù)方枸櫞酸鈉溶液(ACD-A)抗凝劑平均用量為350 mL，處理時(shí)間為(74±21) min。單采濃縮紅細(xì)胞時(shí)，以同樣速度輸入等量的乳酸林格液和低分子右旋糖酐。治療前先靜脈推注10%葡萄糖酸鈣10 mL，治療后根據(jù)ACD-A用量決定是否追加10%葡萄糖酸鈣，以預(yù)防枸櫞酸鹽中毒反應(yīng)[6]。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 50例初診為HAPC的患者均為男性，年齡范圍28～76歲，中位年齡為48歲，其中藏族41例，漢族9例?；颊咴谌朐汉缶邮艹掷m(xù)低流量吸氧和改善循環(huán)治療，并行紅細(xì)胞單采術(shù)，藏、漢兩族患者初診時(shí)血紅蛋白等的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 50例HAPC患者的一般資料比較

高原地區(qū)血液檢查正常參考值： 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)為(4.3～5.8)×1012/L，血紅蛋白為130～175 g/L，血細(xì)胞比容為0.40～0.50，白細(xì)胞計(jì)數(shù)為(3.5～9.5)×109/L，血小板計(jì)數(shù)為(125～350)×109/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值為(22～83)×109/L，血清總膽紅素為3.4～17.1 μmol/L，血清間接膽紅素為0～22 μmol/L，乳酸脫氫酶為110～245 U/L10例正常對(duì)照者均為男性，其中藏族8例，漢族2例，年齡范圍25～64歲，中位年齡為37歲，血紅蛋白水平(149.8±10.0) g/L。

2.2 紅細(xì)胞壽命測(cè)定 HAPC患者治療前血紅蛋白為(229.1±13.9) g/L，內(nèi)源性CO呼氣試驗(yàn)測(cè)得紅細(xì)胞壽命為(69.4±34.5) d，較正常對(duì)照組的(101.5±14.9) d顯著縮短(P=0.001)。其中，藏族患者治療前紅細(xì)胞壽命為(58.1±24.5) d，較正常對(duì)照組顯著縮短(P=0.001)；漢族患者治療前紅細(xì)胞壽命為(114.6±31.9) d，與正常對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.255)。接受紅細(xì)胞單采術(shù)治療后1周，總體患者血紅蛋白為(170.3±19.7) g/L，紅細(xì)胞壽命為(80.3±28.1) d，后者較治療前顯著延長(zhǎng)(P值均<0.05)。其中，藏族患者治療后紅細(xì)胞壽命為(74.6±27.1) d，較治療前顯著延長(zhǎng)(P=0.005)；漢族患者治療后紅細(xì)胞壽命為(103.0±19.5) d，與治療前的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.340)。見(jiàn)圖1。

圖1 HAPC患者治療前后與正常對(duì)照組紅細(xì)胞壽命情況

2.3 影響紅細(xì)胞壽命的相關(guān)因素分析 初診HAPC患者紅細(xì)胞壽命的相關(guān)因素分析結(jié)果顯示，HAPC患者紅細(xì)胞壽命與外周血血小板計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.320，P=0.023)，與血清維生素B12水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.325，P=0.021)；與患者現(xiàn)實(shí)年齡、初始發(fā)病年齡、病程[發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞增多(或)出現(xiàn)癥狀至檢測(cè)紅細(xì)胞壽命時(shí)]、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、外周血白細(xì)胞分類(lèi)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、血細(xì)胞比容、網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值、網(wǎng)織紅細(xì)胞比例、總膽紅素、間接膽紅素、血清促紅細(xì)胞生成素(EPO)水平、可溶性轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平、血清鐵、鐵蛋白、葉酸等均無(wú)顯著相關(guān)性(P值均>0.05)。

3 討 論

呼氣CO來(lái)源于血紅素降解、非血紅素代謝和外源吸入。內(nèi)源性CO的86%來(lái)自血紅素降解，14%為非血紅素代謝產(chǎn)生。而產(chǎn)生CO的血紅素85%來(lái)自于紅細(xì)胞降解，15%來(lái)自于其他物質(zhì)降解。因此，內(nèi)源性 CO 呼氣試驗(yàn)檢測(cè)紅細(xì)胞壽命的原理是快速檢測(cè)肺泡呼出氣體中CO濃度來(lái)反映即時(shí)機(jī)體紅細(xì)胞的血紅蛋白分解，以間接推算紅細(xì)胞存活情況[7]。Zhang等[4]采用該方法檢測(cè)正常人紅細(xì)胞壽命為(126±26) d，范圍82～215 d，與傳統(tǒng)標(biāo)記法檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。溶血性貧血、真性紅細(xì)胞增多癥(PV)、再生障礙性貧血、慢性腎病等患者的紅細(xì)胞壽命顯著縮短[4-5，7-9]。本研究采用內(nèi)源性CO呼氣試驗(yàn)法測(cè)得正常對(duì)照組的紅細(xì)胞壽命為(101.5±14.9) d，與上述文獻(xiàn)報(bào)道的正常人紅細(xì)胞壽命相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法在高原地區(qū)應(yīng)用的可行性和結(jié)果的可靠性。

紅細(xì)胞壽命檢測(cè)一直被應(yīng)用于紅細(xì)胞增多癥病因及其發(fā)病機(jī)制的研究中。Huff等[10]檢測(cè)PV患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，其紅細(xì)胞壽命縮短。國(guó)內(nèi)學(xué)者于2019年首次報(bào)道采用內(nèi)源性 CO 呼氣試驗(yàn)檢測(cè)PV患者紅細(xì)胞，結(jié)果顯示其紅細(xì)胞壽命較正常人顯著縮短[5]。由于存在基因突變，PV患者體內(nèi)的克隆性紅細(xì)胞大量增殖，縮短紅細(xì)胞壽命或是機(jī)體代償性減少過(guò)量生成的紅細(xì)胞的代償性反應(yīng)。

HAPC的發(fā)病機(jī)制與PV不盡相同，高原地區(qū)的居民長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境，對(duì)缺氧的關(guān)鍵生理反應(yīng)是EPO水平升高，這會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞生成增加。EPO基因受大氣中氧含量調(diào)控[11]。而EPO水平升高是HAPC的主要發(fā)病機(jī)制，但與紅細(xì)胞壽命的關(guān)系仍不清楚。

Bogdanova等[11]發(fā)現(xiàn)，EPO過(guò)表達(dá)小鼠的紅細(xì)胞增多，小鼠紅細(xì)胞中加速老化標(biāo)志物增多，紅細(xì)胞壽命縮短，提示可能是機(jī)體對(duì)紅細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量增加做出的代償性反應(yīng)。國(guó)內(nèi)研究[12]顯示，慢性低氧環(huán)境下，大鼠體內(nèi)被標(biāo)記的成熟紅細(xì)胞增多，表明紅細(xì)胞在高原缺氧環(huán)境下衰亡減緩、壽命延長(zhǎng)。兩組研究均是模擬高原環(huán)境中小鼠紅細(xì)胞變化。本研究直觀地檢測(cè)日喀則市部分HAPC患者體內(nèi)的紅細(xì)胞壽命，結(jié)果顯示藏族HAPC患者紅細(xì)胞壽命顯著縮短，而漢族患者紅細(xì)胞壽命接近正常。這可能與藏漢兩族HAPC患者發(fā)病機(jī)制存在差異有關(guān)。

藏族HAPC患者由于世代生活在高原地區(qū)，機(jī)體已適應(yīng)缺氧環(huán)境。在血液中的含氧量降低時(shí)，藏族HAPC患者體內(nèi)常見(jiàn)的EPAS1基因被激活，通過(guò)上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1-EPO通路觸發(fā)生成更多的紅細(xì)胞[13]。這一機(jī)制使藏族HAPC患者發(fā)病類(lèi)似于PV，即都是由基因功能激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖上調(diào)，因此藏族HAPC患者紅細(xì)胞壽命顯著縮短。漢族HAPC患者在慢性低氧條件下，紅細(xì)胞膜表面磷脂酰肌醇外翻程度降低，紅細(xì)胞內(nèi)CD47的表達(dá)增加，從而使得巨噬細(xì)胞識(shí)別紅細(xì)胞功能下降，導(dǎo)致紅細(xì)胞壽命不縮短[14-15]。

本團(tuán)隊(duì)在前期工作中采用紅細(xì)胞單采術(shù)治療HAPC患者，取得了良好的療效[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞單采術(shù)治療后患者的紅細(xì)胞壽命顯著回升，可能原因是該治療將部分壽命縮短的紅細(xì)胞清除，而新生正常壽命紅細(xì)胞的補(bǔ)充使得整體紅細(xì)胞壽命延長(zhǎng)。

同時(shí)，本研究顯示HAPC患者的紅細(xì)胞壽命與血清維生素B12水平呈負(fù)相關(guān)，但維生素B12與紅細(xì)胞壽命相互影響的機(jī)制尚不明確；患者的血小板計(jì)數(shù)與紅細(xì)胞壽命呈正相關(guān)，這與PV患者情況類(lèi)似，可能與髓系細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，紅細(xì)胞增殖活躍后反饋性抑制血小板生成有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性CO呼氣試驗(yàn)檢測(cè)HAPC患者的紅細(xì)胞壽命較正常人縮短約1/3，漢族HAPC患者外周血血紅蛋白水平顯著增高可能是因?yàn)榧t細(xì)胞衰亡平衡被打破，使得紅細(xì)胞壽命無(wú)法代償性縮短，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞數(shù)量失衡。缺氧環(huán)境中基因功能的變化或是發(fā)生HAPC的根本原因。