芪仙湯提取物緩解苯并芘誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞黏蛋白5AC高表達(dá)的機(jī)制研究

孫亦鵬 史兆雯 倪振華 繆夏軼 林玉華 畢俊杰 王雄彪

支氣管哮喘是我國(guó)的常見(jiàn)病，發(fā)病率約為1%,且呈逐年上升趨勢(shì)，其死亡率居高不下，已成為社會(huì)衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)的沉重負(fù)擔(dān)[1]。黏蛋白(mucin,MUC)5AC是人氣道黏液中的重要蛋白質(zhì)，生理狀態(tài)下呈低表達(dá)。哮喘患者可分泌大量含MUC5AC的黏液，損害氣道纖毛的清除功能，累積形成黏液栓堵塞氣道，致使患者發(fā)生喘息、呼吸困難，甚至窒息[2]。2019年一項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)分析研究[3]結(jié)果顯示，MUC5AC基因的rs11603634位點(diǎn)與中重度哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，且重度哮喘患者的支氣管上皮細(xì)胞中MUC5AC mRNA水平顯著升高。MUC5AC不僅是黏液的組成部分，亦是產(chǎn)生氣道高反應(yīng)的必要條件，降低機(jī)體MUC5AC水平可顯著抑制氣道高反應(yīng)性[4]。因此，MUC5AC有望成為治療哮喘的潛在靶點(diǎn)。

苯并芘[benzo(a)pyrene, BaP]是多環(huán)芳烴類的化學(xué)空氣污染物[5]。有研究[6]結(jié)果表明，BaP與哮喘發(fā)病有關(guān)，能加重哮喘患者的臨床癥狀。BaP可顯著提高M(jìn)UC5AC蛋白質(zhì)或基因的表達(dá)水平，其機(jī)制可能是BaP激活芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平，進(jìn)而上調(diào)MUC5AC的表達(dá)[7-8]。目前尚無(wú)有效藥物可抑制BaP誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)[9]。

中醫(yī)藥物在哮喘治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。芪仙湯是本課題組根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的自擬藥方，由黃芪30 g、仙靈脾30 g、巴戟天30 g、虎杖30 g、川芎15 g、旋覆花9 g、枇杷葉30 g、生地30 g組成，具有化瘀祛痰、補(bǔ)肺益腎的功效。既往研究[10-13]發(fā)現(xiàn)，芪仙湯可改善卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏小鼠的氣道炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生情況，降低外周血免疫球蛋白(Ig)E和輔助性T淋巴細(xì)胞亞群2(Th2)分泌的細(xì)胞因子水平，抑制氣道上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究通過(guò)應(yīng)用芪仙湯干預(yù)BaP誘導(dǎo)人支氣管黏液上皮樣細(xì)胞NCI-H292細(xì)胞株，制造MUC5AC高表達(dá)的細(xì)胞模型，觀察該提取物對(duì)MUC5AC表達(dá)的影響， 并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 NCI-H292細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Cell Counting Kit(CCK)-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)公司，BaP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天公司，ROS/Superoxide試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。MUC5AC、β-肌動(dòng)蛋白(actin)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2 、磷酸化ERK(p-ERK)1/2、相對(duì)分子質(zhì)量為90 000的核糖體S6激酶(RSK)、磷酸化p90(p-p90) RSK抗體，以及羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)CST公司。細(xì)胞色素P450(CYP)1A1購(gòu)自美國(guó)Protein Tech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、1.0 g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的NCI-H292細(xì)胞株置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中，隔天換液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①檢測(cè)細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)，以不同質(zhì)量濃度(0、60、120、240、480、960 μg/mL)的芪仙湯提取物處理細(xì)胞48 h，分為6組。②其他實(shí)驗(yàn)均將細(xì)胞分為4組：空白組(以二甲基亞砜處理)、模型組(以BaP 10 μmol/L處理)、芪仙湯低濃度組(以BaP 10 μmol/L處理+芪仙湯提取物240 μg/mL處理)和芪仙湯高濃度組(以BaP 10 μmol/L+芪仙湯提取物 480 μg/mL處理)。檢測(cè)MUC5AC蛋白質(zhì)和mRNA水平時(shí)，BaP與芪仙湯提取物同時(shí)處理細(xì)胞48 h；檢測(cè)ROS活性、ERK通路蛋白質(zhì)和CYP1A1蛋白質(zhì)水平時(shí)，BaP與芪仙湯提取物同時(shí)處理細(xì)胞24 h。其中， AhR激活后可促進(jìn)CYP1A1基因轉(zhuǎn)錄，因此CYP1A1水平升高可作為AhR激活的標(biāo)志[14]。

1.2.3 芪仙湯提取物制備 采用芪仙湯水提物，具體制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[13] 。

1.2.4 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 收集NCI-H292細(xì)胞株，以每孔7×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，分別加入不同質(zhì)量濃度的芪仙湯提取物處理細(xì)胞48 h，棄上清液，每孔加入CCK-8溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為450 nm處各孔細(xì)胞的吸光度值。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè) 收集NCI-H292細(xì)胞株，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板。細(xì)胞貼壁過(guò)夜后，分別加入藥物處理24 h。棄上清液，以無(wú)血清培養(yǎng)基將5 mmol/L的氧化應(yīng)激探針以1∶1 000稀釋倍數(shù)加入孔內(nèi)，于37 ℃避光孵育30 min，以1×PBS洗3遍，置于熒光顯微鏡下觀察并拍攝各組細(xì)胞狀態(tài)，應(yīng)用Image pro plus 6.0軟件將熒光強(qiáng)度轉(zhuǎn)換為吸光度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書將樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用TaKaRa熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)MUC5AC、CYP1A1 mRNA水平，反應(yīng)條件：94 ℃ 10 min, 94 ℃ 30 s ，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin基因作為內(nèi)參，ΔCt=樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值，ΔΔCt=ΔCt-(隨機(jī)陰性對(duì)照樣品Ct均值-內(nèi)參Ct均值)，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 取等量蛋白質(zhì)樣本行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，以TBST緩沖液+5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉2 h。將膜分別與相應(yīng)一抗置于4 ℃孵育過(guò)夜，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔或抗鼠IgG二抗，置于室溫孵育2 h。再以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，最后加入ECL發(fā)光液，應(yīng)用Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影，以Image J軟件計(jì)算各組目的蛋白質(zhì)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 芪仙湯提取物對(duì)NCI-H292細(xì)胞株活力的影響 經(jīng)60、120、240、480 μg/mL的芪仙湯提取物處理后的NCI-H292細(xì)胞株存活率分別為(100.57±0.10)%、(100.40±0.03)%、(101.63±0.07)%、(96.20±0.06)%，與0 μg/mL的芪仙湯提取物處理后的(99.70±0.05)%比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。經(jīng)960 μg/mL的芪仙湯提取物處理后的NCI-H292細(xì)胞株存活率為(45.95±0.04)%，顯著低于0 μg/mL的芪仙湯提取物處理組(P<0.05)。綜合考量，本研究選用240、480 μg/mL分別作為芪仙湯提取物的低、高濃度。

2.2 芪仙湯提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)MUC5AC蛋白質(zhì)及其mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組MUC5AC蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著升高(P值均<0.01)。與模型組比較，芪仙湯低、高濃度組的MUC5AC蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著降低(P<0.05或0.01)。見(jiàn)圖1和表2。

1 空白組 2 模型組 3 芪仙湯低濃度組 4 芪仙湯高濃度組圖1 芪仙湯提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的MUC5AC蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

表2 4組MUC5AC蛋白質(zhì)和mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 芪仙湯提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)氧化應(yīng)激水平的影響 模型組細(xì)胞株ROS熒光強(qiáng)度值為2 296.67±310.16，顯著高于空白組的105.00±14.52(P<0.01)；芪仙湯低、高濃度組細(xì)胞株ROS熒光強(qiáng)度值分別為(1 576.00±339.26)、(762.00±209.52)，均顯著低于模型組(P<0.05或0.01)。見(jiàn)圖2。

A 空白組 B 模型組 C 芪仙湯低濃度組 D 芪仙湯高濃度組圖2 4組細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度

2.4 芪仙湯提取物對(duì)AhR活化的影響 與空白組比較，模型組的CYP1A1蛋白質(zhì)和mRNA水平均顯著升高(P值均<0.01)。與模型組比較，芪仙湯高濃度組CYP1A1蛋白質(zhì)水平顯著降低(P<0.01)，芪仙湯低、高濃度組的CYP1A1 mRNA水平均顯著降低(P值均<0.01)。見(jiàn)圖3和表3。

1 空白組 2 模型組 3 芪仙湯低濃度組 4 芪仙湯高濃度組圖3 芪仙湯提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的CYP1A1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

表3 4組CYP1A1蛋白質(zhì)和mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

2.5 芪仙湯提取物對(duì)ERK通路的影響 p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高是ERK通路被激活的重要標(biāo)志。與空白組比較，模型組p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白質(zhì)水平均顯著升高(P值均<0.01)。與模型組相比，芪仙湯低、高濃度組的p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白質(zhì)水平均顯著降低(P值均<0.01)。見(jiàn)圖4和表4。

1 空白組 2 模型組 3 芪仙湯低濃度組 4 芪仙湯高濃度組圖4 各組p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的比較

表4 4組p-ERK 1/2和p-p90 RSK蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量的比較

3 討 論

氣道黏液是呼吸系統(tǒng)黏膜屏障的重要組成部分。黏液主要由水、脂質(zhì)、糖蛋白和無(wú)機(jī)鹽組成，MUC是糖蛋白的最主要成分，對(duì)于維持黏液的黏稠度和纖毛清除功能具有重要作用。MUC是由杯狀細(xì)胞等分泌的一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，是黏液中主要的大分子物質(zhì)[15]。目前已發(fā)現(xiàn)約20種MUC基因，可分為膜結(jié)合型MUC基因和分泌型MUC基因，分泌型MUC基因又分為聚合型和非聚合型。聚合型MUC基因編碼的蛋白質(zhì)具有復(fù)雜、多種結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)，使其能夠聚合MUC，形成凝膠[16]。研究者聚焦的MUC5AC即分泌型聚合MUC。

MUC5AC表達(dá)異常是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一。MUC5AC高表達(dá)可導(dǎo)致黏液分泌增多，阻塞氣管管腔，導(dǎo)致氣流受阻。哮喘患者大量分泌MUC5AC高表達(dá)的黏稠黏液，黏液不易排出，加重病情[17]。在OVA致敏小鼠的肺組織中發(fā)現(xiàn)，MUC5AC蛋白質(zhì)高表達(dá)，黏液阻塞氣道，而敲除MUC5AC基因的OVA致敏小鼠的氣道黏液阻塞比例降低了74%[4]，藥物干預(yù)也可達(dá)到類似的效果[18]；MUC5AC的高表達(dá)還可導(dǎo)致哮喘患者的氣道高反應(yīng)。敲除MUC5AC基因的OVA致敏小鼠對(duì)乙酰甲膽堿的反應(yīng)性顯著降低，表明敲除MUC5AC可消除OVA引起的氣道高反應(yīng)[4]。因此，抑制MUC5AC蛋白質(zhì)的表達(dá)可改善哮喘患者的病情。

在哮喘發(fā)病過(guò)程中，多種外界刺激因素(如空氣污染物等)會(huì)誘導(dǎo)MUC5AC基因高表達(dá)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，BaP刺激可以顯著誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)，由于BaP是PM2.5的重要組成部分，可解釋PM2.5能誘導(dǎo)MUC5AC高表達(dá)的原因[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)，AhR介導(dǎo)的ROS和ERK激活在BaP誘導(dǎo)的MUC5AC水平升高中起到重要作用，BaP激活A(yù)hR后可使細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，誘導(dǎo)EKR信號(hào)通路活化，從而促進(jìn)MUC5AC蛋白質(zhì)表達(dá)；芪仙湯提取物可抑制AhR活化，進(jìn)一步抑制ROS和ERK的激活。芪仙湯復(fù)方的有效成分可以通過(guò)多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)AhR的表達(dá)和活性變化，如Chi等[21]發(fā)現(xiàn)淫羊藿的單體之一淫羊藿苷可抑制AhR基因的表達(dá)，Ciolino等[22]則發(fā)現(xiàn)虎杖的單體之一白藜蘆醇可與AhR核轉(zhuǎn)位因子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)形成復(fù)合物從而抑制AhR入核。因此，筆者認(rèn)為芪仙湯提取物主要通過(guò)其有效成分(白藜蘆醇或淫羊藿苷等)從多靶點(diǎn)抑制AhR的活化，從而削弱BaP對(duì)MUC5AC表達(dá)的誘導(dǎo)。但該結(jié)論尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芪仙湯可下調(diào)BaP誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞中MUC5AC基因和蛋白質(zhì)的高表達(dá)，其機(jī)制可能是抑制了AhR介導(dǎo)的ROS和 ERK通路的活化，相關(guān)研究結(jié)果為緩解PM2.5相關(guān)的哮喘病癥提供了可行的理論基礎(chǔ)。