Klotho在急性腎損傷診斷和治療的研究進(jìn)展

王 喆 綜述 姜埃利 審校

急性腎損傷(AKI)是以腎功能的迅速惡化為特征的臨床常見疾病。10%～15%住院患者存在AKI，重癥監(jiān)護(hù)室中AKI的患病率超過50%[1]。持續(xù)惡化的AKI增加住院率、慢性腎臟病(CKD)、終末期腎病(ESRD)及死亡風(fēng)險，同時AKI增加卒中、心血管疾病、上消化道出血等風(fēng)險，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此，需要可靠的生物學(xué)標(biāo)志物早期診斷AKI，早期治療，進(jìn)而減輕腎臟損傷。此外，腎臟組織具有一定的修復(fù)能力，需要深入了解相關(guān)機(jī)制，采用新的治療方法促進(jìn)腎臟功能的恢復(fù)，改善患者預(yù)后。Klotho主要來源于腎臟，以往研究多關(guān)注Klotho對慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨異常的調(diào)節(jié)作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Klotho在AKI早期呈現(xiàn)特征性變化，診斷AKI的敏感性和特異性優(yōu)于傳統(tǒng)標(biāo)記物，可能成為AKI早期診斷的新型生物學(xué)標(biāo)記物。同時，體內(nèi)和體外研究均發(fā)現(xiàn)Klotho在不同病因?qū)е碌腁KI中均存在腎保護(hù)作用，可能成為AKI治療的新靶點(diǎn)。本文綜述Klotho在AKI診斷和治療中的研究進(jìn)展。

Klotho的來源和生物學(xué)作用

Klotho發(fā)現(xiàn)于1997年，是一種抗衰老基因，位于染色體13q12。Klotho主要表達(dá)于腎遠(yuǎn)曲小管，其次是近曲小管，也表達(dá)于腦、胰腺、甲狀旁腺等器官。Klotho有膜型和分泌型兩種形式。膜型Klotho是其基因編碼的130 kD單次跨膜蛋白。蛋白酶可以裂解Klotho的部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生分泌型Klotho。分泌型Klotho也來自于可變剪接。分泌型Klotho釋放到血液循環(huán)成為可溶性Klotho。可溶性Klotho作用于骨骼、腦、心臟、肺、內(nèi)皮細(xì)胞等多種遠(yuǎn)端器官。Klotho可以結(jié)合成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)受體1，增加FGF23與其受體的親和力，抑制腎臟對磷的重吸收，促進(jìn)尿磷排泄。Klotho直接促進(jìn)腎近曲小管鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)化和降解，增加尿磷排泄。Klotho還具有多種生物學(xué)作用：抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抗凋亡，以及上調(diào)自噬[3]。

對AKI的診斷價值

現(xiàn)有診斷AKI的血、尿生物標(biāo)志物血清肌酐(SCr)是診斷AKI常用的生物標(biāo)記物，但是它受年齡、性別、肌肉含量、飲食情況、藥物、殘余腎功能等因素影響，診斷AKI的敏感度和特異度均較低[1]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的AKI早期診斷的生物標(biāo)記物包括：中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、腎損傷分子1(KIM-1)和白細(xì)胞介素18(IL-18)[4]。大型前瞻性多中心研究發(fā)現(xiàn)，血漿NGAL、尿液NGAL、尿液KIM-1和尿液IL-18診斷AKI的ROC曲線下面積均<0.77[5-6]。因此，我們亟需可靠的生物標(biāo)記物對AKI進(jìn)行早期診斷和評估預(yù)后。

血漿和腎臟Klotho在AKI早期診斷的應(yīng)用多項(xiàng)研究分析了Klotho在不同病因AKI的表達(dá)情況，并探討Klotho對AKI的診斷價值(表1)。Hu等[7]建立小鼠的腎缺血再灌注損傷(IRI)的AKI模型。術(shù)后第1天和第2天，腎臟Klotho蛋白質(zhì)和mRNA均降低。術(shù)后第7天，腎臟、血漿、尿液Klotho水平與陰性對照組接近。血漿和腎臟Klotho水平在IRI后1h升高，3h后迅速降低。血漿和腎臟NGAL水平在IRI后5h才開始升高。因此，Klotho可能是腎損傷的最早期的生物標(biāo)記物。王順等[8]將重癥監(jiān)護(hù)病房的患者分為AKI組和非AKI組，AKI組患者基線血清Klotho水平低于非AKI組。血清Klotho早期診斷AKI 的曲線下面積為0.945，臨界值為1.76 μg/L，敏感性92%，特異性94%，其敏感性高于NGAL，特異性相近。Seo等[9]分析不同病因AKI患者的腎臟Klotho水平，其與SCr水平呈負(fù)相關(guān)，組織學(xué)檢查顯示Klotho低值組腎損傷較重。Liu等[10]觀察了心臟瓣膜置換術(shù)后的AKI患者，術(shù)后0h血清Klotho預(yù)測AKI的ROC曲線下面積為0.806，臨界值是119.145 U/L，敏感度和特異度分別為0.895、0.572。SCr和胱抑素C診斷AKI的ROC曲線下面積分別為0.875和0.742。Klotho診斷AKI的特異度及敏感度均高于SCr，敏感度高于NGAL。Seibert等[11]研究結(jié)果不同于以往研究，人體非手術(shù)相關(guān)AKI中，急性腎損傷網(wǎng)絡(luò)(AKIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的血Klotho分別為485.3 pg/ml、432 pg/ml、748.4 pg/ml，AKIN分級越高、估算的腎小球?yàn)V過率(eGFR)越低，血清Klotho越高?？赡茉撗芯繘]有在腎損傷早期檢測Klotho，錯過了血清Klotho的下降期，但是在臨床工作中，很難確定非手術(shù)相關(guān)腎損傷的檢測截點(diǎn)。AKI病因差異也可能影響Klotho表達(dá)。尿液中Klotho能預(yù)測AKI，Qian等[12]評價了尿液Klotho對心臟術(shù)后AKI的預(yù)測作用，AKI患者術(shù)后0h尿液Klotho高于非AKI患者。尿液Klotho診斷AKI的曲線下面積為0.86，臨界值是0.86 ng/μmol，敏感度93.9%，特異度75.9%。AKI 2期和3期患者尿液Klotho水平高于1期。AKI 2期和3期患者尿液Klotho持續(xù)升高7d。腎功能未恢復(fù)的患者尿液Klotho高于腎功能完全恢復(fù)的患者。Klotho蛋白表達(dá)于刷狀緣的頂端，AKI中近曲小管上皮細(xì)胞刷狀緣被破壞消失，這可能導(dǎo)致AKI早期尿液Klotho急劇升高。隨著AKI的進(jìn)展，腎小管上皮細(xì)胞壞死和脫落，Klotho隨之脫落，導(dǎo)致AKI中尿液Klotho的持續(xù)升高，尿液Klotho增加可能提示腎小管損傷的嚴(yán)重程度。因此，尿液Klotho可能成為早期診斷AKI的生物標(biāo)記物，并且預(yù)測心臟術(shù)后短期腎功能。但是該研究結(jié)果與Hu等[7]的研究矛盾。Hu等[7]發(fā)現(xiàn)AKI患者尿液Klotho低于健康對照組。研究結(jié)果的差異可能是尿液標(biāo)本預(yù)處理和采集時間不同。尿液中的Klotho不穩(wěn)定，反復(fù)凍融會降低Klotho的濃度[13]。AKI患者尿液Klotho持續(xù)升高7d，采集時間過晚會導(dǎo)致結(jié)果差異。此外，AKI病因不同也可能影響研究結(jié)果，Qian等[11]研究對象是心臟術(shù)后AKI患者，而Hu的研究中AKI病因包括膿毒癥、高血壓、慢性腎臟病、腎毒性藥物相關(guān)的腎損傷等。不同的檢測方法、樣本量較少也會造成結(jié)果差異。

表1 Klotho在AKI中的變化特點(diǎn)和診斷價值

尿液Klotho鑒別腎性AKI和腎前性AKI Kim等[14]認(rèn)為尿液Klotho水平可能有助于鑒別腎性和腎前性AKI。腎性AKI組的尿液Klotho顯著高于腎前性AKI組。腎前性AKI組的腎組織接近正常，或輕度刷狀緣脫落。腎性AKI組刷狀緣明顯脫落，大量腎小管顯著擴(kuò)張，細(xì)胞核消失，間質(zhì)炎癥滲出。腎性AKI組的組織損傷指數(shù)顯著高于腎前性AKI組。腎前性AKI組的腎臟Klotho表達(dá)明顯低于腎性AKI組。

腎保護(hù)作用的機(jī)制以及潛在治療靶點(diǎn)

Klotho在不同病因?qū)е碌腁KI中均表現(xiàn)腎保護(hù)作用，維持腎臟組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)，通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等作用改善腎功能，可能是AKI治療的新靶點(diǎn)(表2)。

表2 Klotho在AKI中腎保護(hù)作用的機(jī)制以及潛在治療靶點(diǎn)

缺血再灌注損傷腎臟缺血再灌注損傷包括腎臟缺血性損傷和再灌注損傷，氧自由基形成，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管滲透性增加，中性粒細(xì)胞、血小板、細(xì)胞因子和補(bǔ)體系統(tǒng)活化，造成急性腎損傷(圖1A)，多見于腎移植、心臟手術(shù)、膿毒癥等[15]。氧自由基引發(fā)腎小管上皮細(xì)胞的程序性壞死，參與腎缺血再灌注損傷的病理生理過程。在IRI導(dǎo)致AKI的動物模型中，腎小管細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞程序性壞死，伴隨氧化應(yīng)激反應(yīng)，血清和腎臟Klotho降低，尿液Klotho升高，Klotho治療可以降低細(xì)胞程序性壞死的標(biāo)志物[受體相互作用蛋白激酶3(RIP3)、IL-1β和TUNEL陽性細(xì)胞]。Klotho降低8羥基脫氧鳥苷(u-8-OHdG)、腎臟的丙二醛(MDA)和3-硝基酪氨酸，增加超氧化物歧化酶(SOD)和含錳的超氧化物歧化酶(SOD2)。提示Klotho具有抗氧化應(yīng)激作用，并抑制腎小管細(xì)胞的程序性壞死[17]。我國的一項(xiàng)研究中，Klotho 治療組SCr和尿素氮低于對照組，血清一氧化氮(NO)升高，腎組織過氧化物酶含量減少， SOD增多，推測Klotho 腎保護(hù)作用與其抗氧化作用相關(guān)，也可能通過增加NO含量擴(kuò)張腎臟血管及改善腎臟血供[17]，Klotho激活叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)，F(xiàn)OXO激活促進(jìn)多種抗氧化基因的表達(dá)，包括過氧化氫酶、SOD2，發(fā)揮抗氧化作用[18](圖1A)。

圖1 A:IRI導(dǎo)致AKI的機(jī)制;B:Klotho在AKI中的腎保護(hù)作用[26]IRI:腎缺血再灌注損傷；AKI：急性腎損傷；NO：一氧化氮；FOXO：叉頭轉(zhuǎn)錄因子；SOD2:超氧化物歧化酶2

Hu等[7]建立鼠AKI模型，與野生型組比較，Klotho轉(zhuǎn)基因組的腎組織損傷評分顯著降低，肌酐清除率并不高于對照組，說明Klotho過表達(dá)不增加腎小球?yàn)V過率。NGAL是已知的腎保護(hù)物質(zhì)，給予外源性NGAL可以緩解腎IRI，促進(jìn)細(xì)胞再生和組織修復(fù)，上調(diào)內(nèi)源性腎臟NGAL mRNA和蛋白質(zhì)，這可能是Klotho改善腎IRI的潛在機(jī)制[19]。

重組α-Klotho減輕氧化應(yīng)激、增加NO，抑制腎小管細(xì)胞程序性壞死，抑制炎癥因子，上調(diào)內(nèi)源性NGAL表達(dá)，減少腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣的脫落，增加內(nèi)源性Klotho表達(dá)，改善腎功能[7,20-24]。在IRI的AKI模型中[25]， 連續(xù)4d給予重組α-Klotho后，肌酐清除率和內(nèi)源性血漿α-Klotho升高，α平滑肌肌動蛋白降低，提示α-Klotho可抑制腎臟纖維化。早期、短期使用重組α-Klotho可持續(xù)改善腎功能和結(jié)構(gòu)，防止AKI向CKD進(jìn)展。

Klotho治療時機(jī)影響AKI的預(yù)后。在IRI后30 min注射Klotho，腎組織損傷減輕，改善腎小球?yàn)V過率，療效優(yōu)于60 min時內(nèi)給藥，早期治療更利于改善預(yù)后[7]。

化學(xué)藥物相關(guān)AKI 腎毒性藥物促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞壞死和凋亡，激活炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和自噬，導(dǎo)致腎損傷[27]。在順鉑導(dǎo)致的AKI中， Klotho降低腎臟細(xì)胞表達(dá)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2(OCT2)，同時降低OCT活性，減少細(xì)胞攝取順鉑。Klotho調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2和caspase-3信號級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生抗凋亡作用，獨(dú)立于抗順鉑攝取作用[20]。Oh等[21]采用碘帕醇建立AKI模型， AKI組的Klotho mRNA和蛋白質(zhì)低于對照組，氧化應(yīng)激和凋亡指標(biāo)升高。重組Klotho通過抑制氧化應(yīng)激和凋亡減輕碘帕醇導(dǎo)致的AKI。

膿毒癥性AKI 膿毒癥通過缺血再灌注損傷、炎癥反應(yīng)、微循環(huán)功能障礙、線粒體損傷和代謝改變，造成腎損傷[28]。Klotho的缺乏加重了膿毒癥和多器官功能障礙。在Klotho單倍體不足的雜合子鼠及其同窩幼鼠中建立膿毒癥模型，Klotho缺乏組生存率較低，存在腎損傷、肝損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，炎癥介質(zhì)和核子因κB(NF-κB)活性增加，交感神經(jīng)活性減弱，心率變異性減低，對硝普鈉的壓力反射功能降低，提示Klotho缺乏加重膿毒癥和多器官功能障礙[29]。陳薪薪等[30]發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠AKI腎組織中Klotho減少、自噬增強(qiáng)，兩者均具有時間依賴性。重組Klotho能緩解腎損傷，恢復(fù)腎臟內(nèi)源性Klotho表達(dá)。但是，重組Klotho沒有影響腎組織表達(dá)自噬標(biāo)記物(LC-3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62)，說明重組Klotho可能沒有增加自噬，Klotho的腎保護(hù)作用可能與其他機(jī)制相關(guān)[22]。孫敏等[23]發(fā)現(xiàn)，Klotho治療組腎小球和小管上皮細(xì)胞水腫減輕，小管腔內(nèi)透明管型減少，血清肌酐和尿素氮下降，線粒體結(jié)構(gòu)相對完整，線粒體氧化應(yīng)激因子下降。腎組織Klotho蛋白、Bcl-2表達(dá)升高，細(xì)胞色素C下降，提示Klotho蛋白可以維持線粒體結(jié)構(gòu)完整，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)腎功能。

Liu等[24]發(fā)現(xiàn)Klotho具有抗氧化應(yīng)激和炎癥調(diào)節(jié)作用。在脂多糖(LPS)建立鼠的膿毒癥AKI模型中，腎臟α-Klotho降低。給予外源性α-Klotho后，血清肌酐和NGAL降低，提示α-Klotho能夠減輕AKI，α-Klotho高劑量組腎臟恢復(fù)更明顯。α-Klotho持續(xù)降低氧化應(yīng)激標(biāo)記物(丙二醛、活性氧自由基、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶和NO)，活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記物[(葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和XBP1]，降低IL-1、IL-6和腫瘤壞死因子α，升高IL-10，說明α-Klotho抑制促炎因子，刺激抗炎因子，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境。

橫紋肌溶解導(dǎo)致AKI 橫紋肌溶解后大量肌紅蛋白進(jìn)入血液循環(huán)，阻塞腎小管，伴隨炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，引起腎小管上皮細(xì)胞壞死和凋亡，導(dǎo)致腎損傷[31]。在橫紋肌溶解相關(guān)的AKI的模型中，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)程序性壞死，尿液外泌體(uEVs)含有Klotho，uEVs治療降低血尿素氮和肌酐，降低腎損傷標(biāo)志物[NGAL、纖溶酶原激活物抑制劑、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和SOX9]，降低促炎因子(腫瘤壞死因子-α，IL-1β和IL-6)。uEVs中的miRNA通過uEVs轉(zhuǎn)運(yùn)到腎組織，抑制啟動子甲基化，參與上調(diào)Klotho，恢復(fù)正常的Klotho水平。uEVs參與上調(diào)Klotho，補(bǔ)償內(nèi)源性Klotho，改善腎小管上皮細(xì)胞的程序性壞死，促進(jìn)了腎小管細(xì)胞的增殖，降低炎癥標(biāo)記物。外泌體是天然來源的物質(zhì)，在血液循環(huán)中穩(wěn)定性較高，可以通過工程學(xué)的方法轉(zhuǎn)運(yùn)分子，可能成為理想的治療方法。來自健康人的uEVs可能是囊泡的新來源，具有促進(jìn)再生的特性，影響Klotho的調(diào)節(jié)[32]。

Klotho基因治療可以改善腎組織損傷和細(xì)胞凋亡，降低SCr[33]。采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得高效表達(dá)Klotho 基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，過表達(dá)Klotho 基因上調(diào)腎臟血管內(nèi)皮生長因子，減輕腎臟損傷，促進(jìn)腎功能恢復(fù)[34]。

展 望

AKI導(dǎo)致Klotho可逆性的降低，低水平的Klotho加重腎損傷。Klotho具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、抗凋亡等多種生物學(xué)功能,促進(jìn)AKI后腎臟結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。故Klotho是AKI的早期生物標(biāo)記物，可以保護(hù)腎功能，是潛在的治療靶點(diǎn)。

由于血清和尿液Klotho在AKI后的達(dá)峰和持續(xù)時間不同，需要在腎損傷后進(jìn)行連續(xù)性評估，明確AKI進(jìn)程中血清和尿液Klotho隨時間變化的規(guī)律，從而確定標(biāo)本采集時間。需要通過長期隨訪的臨床研究評價血清和尿液Klotho水平對AKI的預(yù)測價值。