水冬瓜葉的生藥學(xué)及其近紅外快速鑒別技術(shù)研究?

韓忠耀 王傳明 宋 偉 劉承貴

（黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000）

水冬瓜葉來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木[Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu]的干燥葉，水冬瓜葉與水冬瓜根皮為山茱萸科植物有齒鞘柄木不同用藥部位[1]，其植物體屬于落葉小喬木。該藥在貴州省分布較廣，且野生藥材資源豐富，在貴州省內(nèi)的黔南、畢節(jié)、遵義、貴陽等地均產(chǎn)。

近年來，有關(guān)落葉小喬木山茱萸科植物有齒鞘柄木的研究，主要集中在其藥用部位水冬瓜根皮的化學(xué)成分[2-5]、高效液相色譜指紋圖譜研究[6-7]、藥理作用[8-9]、工藝優(yōu)化[10]、含量測定[11-12]、近紅外快速檢測[13]、病蟲害種類及野生資源破壞情況調(diào)查[14]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究[15]等方面。近紅外光譜技術(shù)是近年來發(fā)展迅速且應(yīng)用范圍較廣的新技術(shù)，檢測時主要利用近紅外光譜區(qū)與被檢測物質(zhì)有機(jī)分子中含氫基團(tuán)（O—H、N—H、C—H）振動的合頻和各級倍頻的吸收區(qū)一致，通過掃描樣品的近紅外光譜，以得到樣品中有機(jī)分子含氫基團(tuán)的特征信息。由于其快速、綠色無污染、不破壞樣品、高效等優(yōu)點(diǎn)[16-18]，在林產(chǎn)工業(yè)[19]、中藥材快速真?zhèn)舞b別與含量測定[20-21]、食品無損檢測及摻雜[22-24]等均有廣泛應(yīng)用。徐燃等[25]針對湖北產(chǎn)山茱萸科植物有齒鞘柄木的藥用部位根皮（大接骨丹）開展了生藥學(xué)鑒定研究，而有關(guān)落葉小喬木水冬瓜葉的生藥學(xué)研究及近紅外光譜（NIR）快速真?zhèn)舞b別研究尚未見報道。

本研究以水冬瓜葉為研究對象，從性狀、表皮細(xì)胞及顯微鑒別特征對其進(jìn)行研究，并利用近紅外光譜法建立水冬瓜葉藥材主成分分析（PCA）快速真?zhèn)味ㄐ澡b別模型，以期為更好地開發(fā)利用民族藥落葉小喬木水冬瓜葉藥材資源提供參考與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用水冬瓜葉、根皮及樹皮藥材為自采，采集地點(diǎn)為貴州省都勻杉木湖溝渠、長順縣、惠水縣等地，經(jīng)鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木的葉、根皮與樹皮。其中水冬瓜葉藥材采集共48 批次（編號Y1～Y48），水冬瓜樹皮（編號S1～S6）、根皮（編號G1～G6）分別采集6 批次。Y1～Y42 用于近紅外建模，G1～G6 和S1～S6作為偽品驗(yàn)證用，Y43～Y48 作為正品驗(yàn)證用。樣品采集信息見表1。

表1 藥材采集信息表Tab.1 Information of collected medicinal materials

試劑：水合氯醛（武漢博萊特化工有限公司）、稀甘油（山東磊林商貿(mào)有限公司）、甲醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）等，以上試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備

試驗(yàn)主要設(shè)備與儀器：OLYMPUS CX31 光學(xué)顯微鏡成像顯微系統(tǒng)，奧林巴斯有限公司；烘箱，型號：101-3AB型，天津市泰斯特儀器有限公司；高速粉碎機(jī)，型號：WK-1000A，濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司；藥典篩，紹興市上虞張興紗篩廠；Luminar 5030型AOTF-NIR近紅外光譜儀，主要部件包括光學(xué)部分、控制部分、電源適配器，軟件包括SNAP!光譜處理軟件，美國Brimrose公司；The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件，挪威CAMO公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 性狀鑒別

對水冬瓜葉新鮮植物體與干燥藥材進(jìn)行觀察研究，描述其性狀特征。

1.3.2 顯微鑒別

1) 表面制片法。采用“表面撕離法”，用鑷子將新鮮水冬瓜葉的表皮輕輕撕下，將面朝上，置于載玻片上，滴加水合氯醛適量，蓋上蓋玻片，觀察水合氯醛水裝片組織學(xué)特征。

2) 粉末顯微特征鑒別。 將陰干后的藥材用粉碎機(jī)打成粉末，過65 目篩[篩孔平均內(nèi)徑(250±9.9）μm]。按照《中華人民共和國藥典》（2015 年版四部）“2001顯微鑒別法”[26]制片，觀察水冬瓜葉粉末顯微特征并拍照。

1.3.3 近紅外快速鑒別

將55 ℃烘干后的藥材用粉碎機(jī)打成粉末，過65 目篩。以漫反射法采集水冬瓜葉藥材（編號Y1～Y48）、6 批次水冬瓜根皮藥材（編號G1～G6）與6 批次水冬瓜樹皮藥材（編號S1～S6）近紅外光譜（NIR）[13]。其中，Y1～Y42 作為建模用校正集，通過NIR軟件將G1～G6（用于偽品驗(yàn)證）、S1～S6（用于偽品驗(yàn)證）與Y43～Y48（用于正品驗(yàn)證）合并后作為驗(yàn)證集，分別采用一階導(dǎo)數(shù)（First derivative，1D）+Savitzky-golay平滑處理等方法對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理。隨后，將水冬瓜葉藥材42 批次預(yù)處理后的NIR導(dǎo)入The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件，建立PCA快速真?zhèn)味ㄐ澡b別模型。模型建立后，將驗(yàn)證集導(dǎo)入The Unscrambler化學(xué)計量學(xué)分析軟件，導(dǎo)入建立的NIR-PCA模型，進(jìn)行模型驗(yàn)證與真?zhèn)舞b別。

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀鑒定結(jié)果

2.1.1 野生水冬瓜葉植物形態(tài)觀察

分別從成熟水冬瓜葉的葉長、葉寬、葉柄長、葉中脈顏色、來源等，對野生水冬瓜葉植物形態(tài)進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。野生水冬瓜葉植物體呈近于闊心形[27]，草綠至深綠色，葉互生，紙質(zhì)，通常有5枚裂片，葉邊緣有稀疏鋸齒；葉柄較長，基部呈鞘狀，見圖1。

表2 野生水冬瓜葉植物形態(tài)測量指標(biāo)結(jié)果（n=6）Tab.2 Morphological measurement indexes of wildToricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves (n=6)

圖1 野生水冬瓜葉植物體形態(tài)圖Fig.1 Picture of wild Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

2.1.2 干燥葉性狀鑒定結(jié)果

圖2 落葉小喬木水冬瓜葉藥材性狀圖Fig.2 Picture of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves for medicinal materials

水冬瓜葉藥材見圖2。藥材多皺縮，邊緣卷曲。完整葉片展開后近于闊心形，長11.8～28.2 cm，寬14.5～36.2 cm；草綠色或黑綠色或棕黑色，先端漸尖，邊緣有疏鋸齒；葉脈淺白色～紅紫色。葉柄長7.4～25.6 cm，葉柄紅紫色或棕褐色。質(zhì)脆易碎。氣微，味淡澀、微苦。一般以葉片完整、色澤草綠或深綠者為佳。

2.2 顯微鑒別結(jié)果

2.2.1 葉表皮

圖3 為水冬瓜葉表皮細(xì)胞圖。由圖可知，水冬瓜葉表皮細(xì)胞排列緊密，形狀較規(guī)則，類長方形，垂周壁的兩個寬邊為近平直形，垂周壁的兩個長邊為近平直形或雙曲弧形，非腺毛分布較多；葉上表皮多類圓形或卵圓形，排列緊密，垂周壁波狀彎曲形，可見平軸式氣孔與螺紋導(dǎo)管。

圖3 水冬瓜葉表皮細(xì)胞圖（×40）Fig.3 Pictures of epidermal cells for Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

2.2.2 水冬瓜葉粉末特征

如圖4 所示，水冬瓜葉粉末呈草綠色。水合氯醛片可見平軸式氣孔，數(shù)量較多。水合氯醛透化片，可見螺紋導(dǎo)管，側(cè)面觀呈同心圓等間距梯度排列，排列較緊密，由一系列筒狀的死細(xì)胞橫壁溶解形成穿孔通道連接而成；草酸鈣方晶可見。

圖4 水冬瓜葉粉末特征圖（×40）Fig.4 Pictures of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves powders

2.3 NIR鑒別結(jié)果

圖5 為樣品的近紅外原始光譜3D圖。PCA模型驗(yàn)證鑒別結(jié)果見圖6。由圖6a可見，近紅外Classification Table（分類表）結(jié)果欄中正品后標(biāo)識為“*”；近紅外分類繪圖（Plot）方法采用Si vs Hi方法時，由圖6b可見，水冬瓜根皮、水冬瓜樹皮、水冬瓜葉分布在不同區(qū)域，其中正品水冬瓜葉樣品“Y43～Y48”分布在“3-區(qū)” ，而水冬瓜根皮、水冬瓜樹皮分布在其他區(qū)域。構(gòu)建的NIR定性鑒別模型快速、準(zhǔn)確地識別了正品樣品“Y43～Y48”。結(jié)果表明：該鑒別模型可用于水冬瓜葉藥材的真?zhèn)舞b別與質(zhì)量控制。

圖5 水冬瓜葉近紅外3D圖Fig.5 NIR-FTIR spectra of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

圖6 水冬瓜葉NIR模型鑒別結(jié)果Fig.6 Model identification results of Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia (Harms) Hu leaves

3 結(jié)論

通過對貴州特色民族藥——落葉小喬木水冬瓜葉進(jìn)行性狀鑒別、表皮細(xì)胞與藥材粉末顯微特征組織學(xué)鑒別研究，得出如下結(jié)論：落葉小喬木水冬瓜葉互生，呈闊心形，先端漸尖；表皮細(xì)胞體積膨大，附有非腺毛、表面有氣孔；落葉小喬木水冬瓜葉藥材粉末鑒別特征包括平軸式氣孔、螺紋導(dǎo)管及草酸鈣方晶，這與文獻(xiàn)報道的根皮部位具有韌皮纖維、具緣紋孔導(dǎo)管、木栓組織碎塊、淀粉粒粉末顯微組織學(xué)特征不同，可作為區(qū)分山茱萸科植物有齒鞘柄木不同用藥部位的顯微鑒別特征[25]。通過優(yōu)化定性定量近紅外建模方法及綜合利用紅外光譜技術(shù)（IR）[28]、近紅外光譜技術(shù)（NIR）可對落葉小喬木水冬瓜葉進(jìn)行快速真?zhèn)舞b別及質(zhì)量評價，且綠色、準(zhǔn)確、簡便，應(yīng)用前景廣。

由于落葉小喬木水冬瓜葉藥材物質(zhì)基礎(chǔ)相關(guān)研究較少，因此，后期以藥效物質(zhì)研究為基礎(chǔ)，可對其開展薄層色譜（TLC）鑒別及化學(xué)成分的液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）快速分析研究[29]，有關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。