錯(cuò)配修復(fù)基因聯(lián)合中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的價(jià)值

陳平，林建光，黃艷，戴煬斌，許天文

0 引言

結(jié)腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除是目前治療結(jié)腸癌的首選方法，但仍有50%～60%的根治性術(shù)后患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]，預(yù)后差，復(fù)發(fā)率高是結(jié)腸癌惡性度高的主要原因。因此尋找結(jié)腸癌遠(yuǎn)期預(yù)后的特異性指標(biāo)顯得尤為重要。近年來，錯(cuò)配修復(fù)基因（mismatch repair gene,MMR）成為腫瘤研究熱點(diǎn)，由于DNA錯(cuò)配修復(fù)基因種系突變可導(dǎo)致區(qū)域內(nèi)體細(xì)胞突變高累積，故又稱為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H），目前公認(rèn)兩者等同（下文統(tǒng)稱deficient mismatch repair,dMMR）[2]。dMMR在Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌中被證明具有明顯的預(yù)后優(yōu)勢(shì)，是結(jié)腸癌治療中重要的生物標(biāo)志物及預(yù)后因子[3]。另外中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率（neutrophil lymphocyte ratio,NLR）作為全身炎性反應(yīng)狀態(tài)的有用指標(biāo)，被認(rèn)為可反映促腫瘤炎性反應(yīng)和抗腫瘤免疫功能之間的平衡，其預(yù)后意義已在結(jié)腸癌等多種實(shí)體瘤中得到廣泛證實(shí)[4]。研究表明dMMR結(jié)腸癌表現(xiàn)出更高水平的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte,TIL）及良好的腫瘤微環(huán)境，這可能是其預(yù)后良好的主要機(jī)制[5]。但是鮮有研究在MMR的背景下研究機(jī)體全身炎性反應(yīng)狀態(tài)，dMMR狀態(tài)下的局部炎性反應(yīng)浸潤(rùn)與全身的炎性反應(yīng)狀態(tài)的聯(lián)系尚無確切的定論。因此通過挖掘MMR與NLR的相關(guān)性，或許可以進(jìn)一步闡述dMMR結(jié)腸癌的預(yù)后機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2015年4月1日—2017年4月1日期間在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院和廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受左/右半結(jié)腸癌根治術(shù)、術(shù)后病理確診為結(jié)腸癌的125名患者資料，其中優(yōu)先納入免疫組織化學(xué)證實(shí)為dMMR狀態(tài)結(jié)腸癌55例，并按標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)納入70例錯(cuò)配修復(fù)基因正常（proficient mismatch repair,pMMR）狀態(tài)結(jié)腸癌用作對(duì)比。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）結(jié)腸癌得到病理證實(shí)，術(shù)后病理進(jìn)行錯(cuò)配修復(fù)蛋白免疫組織化學(xué)分析；（2）術(shù)前均完善了血常規(guī)、生化、腫瘤標(biāo)志物檢查；（3）術(shù)前未接受新輔助放化療及其他輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有第2種原發(fā)性惡性腫瘤；（2）術(shù)前明確合并急性、慢性感染或自身免疫性疾病等；（3）隨訪期間因其他疾病或事件死亡。臨床資料包括年齡、性別、腫瘤病理特征（大小、部位、大體類型、組織學(xué)類型、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期）、CEA、乳酸脫氫酶、術(shù)前NLR、術(shù)后接受化療情況。本研究均經(jīng)所有患者知情同意并獲得授權(quán)簽字（倫理號(hào)：[2019]福醫(yī)附二倫理審字第（116號(hào)））。

1.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)情況。術(shù)后病理報(bào)告經(jīng)高年資病理科醫(yī)師審核確認(rèn)。錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6中出現(xiàn)1個(gè)及以上表達(dá)缺失即判定為dMMR狀態(tài)，未出現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺失即判定為pMMR狀態(tài)。

1.3 NLR值

結(jié)腸癌根治術(shù)前3天內(nèi)所有患者靜脈采血進(jìn)行血常規(guī)檢查。NLR為中性粒細(xì)胞絕對(duì)值和淋巴細(xì)胞絕對(duì)值的比值。確保所有患者術(shù)前無明顯的感染癥狀。

1.4 觀察指標(biāo)

復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)為：本院或外院影像學(xué)檢查（B型超聲、CT、MRI、胸片、腸鏡等）發(fā)現(xiàn)病灶或者直接確診的病理證據(jù)。主要研究指標(biāo)是無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival,RFS）。

1.5 隨訪情況

所有患者均通過門診、電話、微信方式進(jìn)行隨訪，隨訪終點(diǎn)為患者結(jié)腸癌復(fù)發(fā)。數(shù)據(jù)收集截至2020年4月1日，過程中失訪及未復(fù)發(fā)患者作為結(jié)尾數(shù)據(jù)處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析。ROC曲線確定NLR最佳閾值。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。Kaplan-Meier法計(jì)算不同MMR狀態(tài)及NLR組別術(shù)后無病生存率和累計(jì)生存率，Log rank檢驗(yàn)比較各組別生存時(shí)間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌患者的一般資料

共125例患者納入研究，其中男性65例，女性60例。中位年齡 63歲（33～90歲）。按患者M(jìn)MR狀態(tài)分為dMMR組（55例），pMMR組（70例）。

2.2 不同MMR狀態(tài)組臨床病理特征分析

相比pMMR組，dMMR組結(jié)腸癌發(fā)病年齡較低，腫瘤體積更大，分化程度更低，多發(fā)于右半結(jié)腸，更多見神經(jīng)侵犯（均P＜0.05）。在性別、大體類型、組織類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、CEA、乳酸脫氫酶上兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.3 MMR狀態(tài)與術(shù)前NLR相關(guān)性及預(yù)后價(jià)值分析

2.3.1 根據(jù)術(shù)前NLR值和患者腫瘤復(fù)發(fā)情況建立ROC曲線，患者NLR值ROC曲線下面積為0.644。根據(jù)兼顧敏感度和特異性的原則，最終確定NLR=3作為截?cái)嘀?，見圖1。將NLR＜3定義為低NLR值，NLR≥3定義為高NLR值。最終結(jié)果顯示，dMMR組（n=55）中低NLR值40例，高NLR值15例（72.7%vs.27.3%）；pMMR組（n=70）中低NLR值30例，高NLR值40例（42.9%vs.57.1%）。兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 結(jié)腸癌患者臨床資料 (n(%))Table 1 Clinical data of colon cancer patients (n(%))

2.3.2 125例患者隨訪36月。術(shù)后根據(jù)NCCN指南，共77例患者接受術(shù)后輔助化療，dMMR組36例，pMMR組41例（65.5%vs.58.6%）（P＞0.05）。隨訪過程中9例患者未能獲得完整的隨訪資料，將其納入結(jié)尾數(shù)據(jù)分析。結(jié)果3年總復(fù)發(fā)率31.2%。按MMR狀態(tài)和NLR高低，將患者分為四組（分別為dMMR并低NLR組，dMMR并高NLR組，pMMR并低NLR組，pMMR并高NLR組），四組患者數(shù)量，3年無復(fù)發(fā)生存率比較，見表2。組間進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，四組中，dMMR并低NLR組3年無復(fù)發(fā)生存率明顯較高（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果見圖2，組間采用Log rank檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。對(duì)比pMMR并高NLR組，dMMR并低NLR組存在明顯的生存優(yōu)勢(shì)（P＜0.05）；而dMMR并高NLR組、pMMR并低NLR組兩組接近（P＞0.05）。

圖1 結(jié)腸癌患者NLR值ROC曲線Figure 1 ROC curve of NLR value of colon cancer patients

圖2 不同MMR狀態(tài)和NLR水平組的生存分析曲線Figure 2 Survival curves of different MMR status and NLR level groups

3 討論

DNA錯(cuò)配修復(fù)基因系統(tǒng)主要包括4 個(gè)蛋白（MLH 1，PMS 2，MSH 2，MSH 6）,出現(xiàn)1個(gè)及以上表達(dá)缺失即判定為dMMR。在亞洲人群中，dMMR結(jié)腸癌占全部結(jié)直腸癌的5.5%～7.3%[2,6]。近年來，許多的研究皆證實(shí)了dMMR結(jié)腸癌獨(dú)特的預(yù)后優(yōu)勢(shì)，一項(xiàng)Meta分析評(píng)估了1 277例Ⅰ～Ⅳ期dMMR結(jié)腸癌患者，發(fā)現(xiàn)無論早期還是進(jìn)展期疾病，dMMR復(fù)發(fā)率明顯低于pMMR腫瘤，減少死亡風(fēng)險(xiǎn)35%[7]。在對(duì)其機(jī)制的探索中，研究發(fā)現(xiàn)了dMMR結(jié)腸癌獨(dú)特的病理學(xué)特征。例如對(duì)比pMMR結(jié)腸癌，dMMR患者年齡偏低，腫瘤好發(fā)于右半結(jié)腸，癌灶病理分化程度差，多見黏液分泌[8]。這本應(yīng)決定較差的預(yù)后結(jié)果，逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵在于dMMR結(jié)腸癌在宿主-腫瘤相互作用上有更明顯的腫瘤浸潤(rùn)特征，如淋巴反應(yīng)，克羅恩樣淋巴結(jié)節(jié)，包括更多的生發(fā)中心和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[9]，這決定了良好的腫瘤浸潤(rùn)微環(huán)境，患者表現(xiàn)更長(zhǎng)的總生存期（overall survival,OS）、無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival,RFS）[10]。中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（NLR）作為一種反映機(jī)體炎性反應(yīng)程度和免疫狀態(tài)的有用指標(biāo)，被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌等腫瘤的復(fù)發(fā)和預(yù)后關(guān)系密切[3]。但據(jù)我們所知，很少有研究同時(shí)考慮腫瘤的局部和全身炎性反應(yīng)，進(jìn)一步評(píng)估其預(yù)后價(jià)值。有一項(xiàng)胃癌研究表明腫瘤基質(zhì)中高密度的CD4+T細(xì)胞與低NLR相關(guān)，但遺憾的是該研究并沒有表明MMR狀態(tài)[11]。

表2 不同MMR狀態(tài)和NLR水平組的3年無復(fù)發(fā)生存率情況比較 (n(%))Table 2 Comparison of 3-year relapse-free survival rates among groups with different MMR status and NLR level(n(%))

本研究結(jié)果顯示，MMR狀態(tài)與患病年齡、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大小、腫瘤分化程度、癌灶神經(jīng)侵犯相關(guān)。相比pMMR組，dMMR組患者患病年齡低，腫瘤多發(fā)生于右半結(jié)腸，且體積大，腫瘤分化程度低，伴隨神經(jīng)侵犯，這與國(guó)內(nèi)趙喜連等[12]研究結(jié)果相同，區(qū)別在于本研究未能顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度方面的相關(guān)性。但不管如何，兩者均體現(xiàn)出dMMR結(jié)腸癌具有區(qū)別于pMMR的臨床病理特征，表明對(duì)具有該病理特征的結(jié)腸癌更應(yīng)進(jìn)行MMR檢測(cè)，以便提高dMMR篩查的敏感度和特異性，對(duì)指導(dǎo)患者的治療具有重要意義。在對(duì)不同狀態(tài)的術(shù)前NLR值分析后發(fā)現(xiàn)，dMMR與術(shù)前NLR明顯相關(guān)，dMMR組低NLR的患者（72.7%）比例明顯高于pMMR組（42.9%）。既往研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子和趨化因子有利于腫瘤增殖，局部浸潤(rùn)和血管形成，中性粒細(xì)胞增加可加速局部腫瘤的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的形成，增加的腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞濃度可放大至宿主全身性炎性反應(yīng)，可能與積極的臨床結(jié)果相關(guān)，低NLR明顯更有利于腫瘤預(yù)后[4,13]。在本研究中，對(duì)MMR和NLR狀態(tài)分組后進(jìn)行復(fù)發(fā)率的隨訪，我們發(fā)現(xiàn)dMMR并低NLR組3年無復(fù)發(fā)生存率明顯高于其他三組，生存分析顯示相比pMMR高NLR組具有明顯的術(shù)后生存優(yōu)勢(shì)。這提示dMMR低NLR是結(jié)腸癌的良好預(yù)后因素。關(guān)于dMMR狀態(tài)和NLR的聯(lián)系，我們猜測(cè)有以下兩點(diǎn)：一是低NLR可能是良好腫瘤浸潤(rùn)微環(huán)境的全身性體現(xiàn)，兩者互為因果，共同提示結(jié)腸癌的預(yù)后；二是可能存在更復(fù)雜的機(jī)制同時(shí)調(diào)控兩者狀態(tài)。這需要未來更多的研究來證實(shí)。

MMR狀態(tài)和NLR對(duì)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義，但數(shù)據(jù)中仍存在許多不足之處需加以解決。首先，目前關(guān)于NLR的界值尚沒有明確定論，代表全身炎性反應(yīng)狀態(tài)的程度沒有確切說法，既往研究也都是經(jīng)驗(yàn)性的指標(biāo)。根據(jù)最近的評(píng)論[14]，該臨界值介于2到5之間，其在不同的研究、不同的種族都可能有所不同，因此關(guān)于NLR的臨床應(yīng)用，這可能是一個(gè)關(guān)鍵限制。另外，本研究為回顧性研究，術(shù)前缺少NLR的基線值，研究群體樣本量不足，多數(shù)為適合接受手術(shù)的非進(jìn)展期患者，缺乏代表性，且術(shù)后隨訪復(fù)查視患者依從性而定，部分患者真實(shí)復(fù)發(fā)時(shí)間可能延后于隨訪所得時(shí)間，這些均是造成研究結(jié)果偏倚的重要因素；其次，關(guān)于全身炎性反應(yīng)狀態(tài)的指標(biāo)有很多，包括C-反應(yīng)蛋白（CRP）、IL家族細(xì)胞因子、預(yù)后營(yíng)養(yǎng)指數(shù)（PNI），均有相關(guān)的文獻(xiàn)支持其在腫瘤中的應(yīng)用[15]，但因?yàn)椴⒉蛔鳛槌Ｒ?guī)檢測(cè)，因此并沒有被納入本研究，期待未來開展大型的前瞻性研究進(jìn)一步彌補(bǔ)這些短板；最后，重要的一點(diǎn)是我們應(yīng)認(rèn)識(shí)到隨著放化療、靶向治療、免疫治療等多種新興治療手段的出現(xiàn)，結(jié)腸癌的預(yù)后模型構(gòu)建也變得更加的復(fù)雜和困難，未來還有很長(zhǎng)的路要走，需要我們共同努力。

表3 不同MMR狀態(tài)和NLR水平組的Log rank檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Log rank statistics result of different MMR status and NLR level groups

綜上，dMMR結(jié)腸癌具有獨(dú)特的臨床病理特征，聯(lián)合NLR值可用于評(píng)估患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)其影響，應(yīng)注意督促患者復(fù)查隨訪，及時(shí)采取干預(yù)手段，降低結(jié)腸癌死亡率，提高患者生存質(zhì)量。