組織蛋白酶Z基因啟動子部分位點在成人哮喘中的差異性甲基化表達及意義

張黎莎 楊賢苗 錢粉紅

江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸科（江蘇鎮(zhèn)江212001）

支氣管哮喘（簡稱哮喘），是一種由多種細胞及細胞因子參與的慢性炎癥性疾病，在全球范圍內發(fā)病率較高，目前已影響超過3億人［1］。其發(fā)病與遺傳及環(huán)境因素等表觀遺傳學因素密切相關［2-3］。DNA 甲基化作為表觀遺傳調控的重要內容，在轉錄因子調節(jié)、免疫相關通路調控、細胞分化等方面起重要作用［4］。目前研究多關注于DNA 啟動子區(qū)甲基化對基因表達的影響，一般認為啟動子區(qū)低甲基化上調基因表達，反之抑制基因表達，起到類似基因沉默的作用［5］。啟動子的甲基化調控已被證實具有一定生物學價值，不僅與多種癌癥的發(fā)生密切相關［6-7］，也與哮喘發(fā)病存在一定關聯(lián)，已有學者發(fā)現(xiàn)多個與發(fā)病相關的低甲基化位點，且證明其與嗜酸性粒細胞活化、原始T 細胞數(shù)量減少等環(huán)節(jié)相關，亦有研究證明特定基因甲基化改變與交通尾氣引起的哮喘密切相關［8-9］。

組織蛋白酶Z 基因（cathepsin Z gene，CTSZ）位于20 號染色體上一個頻繁擴增區(qū)域［10］。其可通過影響單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫細胞的遷移和吞噬、信號轉導、細胞間通訊、增殖等功能在宿主免疫防御中起關鍵作用［11］。同時，CTSZ 基因被證實可調節(jié)基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase2，MMP2）及基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase9，MMP9）等在氣道重塑中的關鍵基因及蛋白表達［12-13］。但CTSZ 基因及其甲基化水平與哮喘發(fā)病是否相關尚不明確。因此，本研究通過對哮喘患者鼻黏膜上皮細胞中CTSZ 啟動子區(qū)兩位點甲基化水平進行檢測，分析其甲基化程度與患者哮喘控制情況和肺功能的是否存在關聯(lián)，進而為哮喘的診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2017年9月至2020年6月于江蘇大學附屬醫(yī)院呼吸內科門診就診的哮喘患者30 例，其中男20 例，女10 例，平均年齡（41.5 ±10.1）歲。納入標準：（1）年齡18 ～65 歲，無吸煙史有自主行為能力；（2）有明確哮喘診斷病史，符合支氣管哮喘防治指南［14］；（3）無過敏性鼻炎病史，無明顯流涕、鼻塞等鼻部癥狀，近期無鼻腔給藥史。排除標準：（1）有腫瘤、血液病、自身免疫病病史；（2）近1 個月內有上呼吸道感染病史；（3）有除哮喘外的其他呼吸道疾病病史等；（4）糖尿病，高血壓等慢性疾病病史；（5）妊娠狀態(tài)；（6）近1 個月內有糖皮質激素應用史。對照組選取30 例同期、同居住地、年齡相近、性別比例相近，無吸煙史及過敏性病史且與哮喘患者無直接血緣關系的健康體檢者，其中男18 例，女12 例。平均年齡（44.8±8.3）歲。本研究通過江蘇大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準（批準號SWYXLL20200121-6）且全部受試者均已簽署知情同意書。

1.2 分組標準由呼吸科醫(yī)生按照哮喘控制測試問卷進行評分，根據(jù)評分結果將患者分為三組。25 分為控制組、20 ～24 分為部分控制組、19 分以下為未控制組。

1.3 樣本采集及檢測

1.3.1 鼻腔樣本采集清潔鼻腔，少量生理鹽水濕潤鼻腔后以鼻刮匙于下鼻甲處反復輕刮5 ～10 次，將刮匙下端置入預先配置好的0.1%膠原酶溶液中，震蕩數(shù)分鐘，37 ℃水浴消化至無明顯絮狀物，12 000 r/min 離心5 min，PBS 清洗后再次離心置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA 提取及甲基化水平檢測凍存細胞放至室溫后再次離心，按照DNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）使用說明書提取DNA，檢測其質量合格后使用重亞硫酸鹽法處理DNA，以Methyl Target 測序法檢測甲基化水平，測序實驗委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.3.3 FEV1及FVC測定使用日本CHEST HI-101肺功能儀檢測進行測定，由同一技術人員操作以保證操作符合歐洲呼吸學會標準［15］。患者測試前未吸入支氣管擴張劑，重復測定3 次，誤差＜5%，取最佳測量值，記錄FEV1pred%及FEV1/FVC。

1.4 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件處理，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差表示，以兩獨立樣本t檢驗比較差異性。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，以U 檢驗比較兩組間差異性。DNA 甲基化水平與哮喘患者肺功能水平相關性采用Spearman相關分析。采用MedCalc 軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），通過曲線下面積（AUC）、敏感性、特異性、約登指數(shù)等來判斷甲基化水平用于哮喘診斷的效能。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 入組患者基本資料哮喘患者與對照組在年齡、性別、BMI等方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），入組時肺功能顯著低于正常對照組（P＜0.05）。

表1 哮喘組及健康對照組一般臨床資料Tab.1 Characteristics of patients and healthy controls ±s

表1 哮喘組及健康對照組一般臨床資料Tab.1 Characteristics of patients and healthy controls ±s

年齡（歲）女性［例（%）］BMI FEV1/FVC［M（P25，P75），%］FEV1pred［M（P25，P75），%］哮喘組（n=30）41.5±10.1 10（33.3）25.2±2.1 85.7（78.4，88.9）66.6（62.5，77.1）對照組（n=30）44.8±8.3 12（40.0）24.9±2.4 96.8（95.8，98.3）95.2（92.8，97.8）P 值0.164 0.595 0.652＜0.001＜0.001

2.2 兩組間甲基化差異如圖1 所示，哮喘患者CTSZ 啟動子區(qū)域兩位點均呈顯著低甲基化，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 甲基化水平定量分析Fig.1 Quantitative detection of methylation level

2.3 甲基化水平與哮喘控制情況兩位點均在控制組中呈明顯低甲基化表達，且甲基化水平隨哮喘控制情況好轉逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（cg01623438 位 點P＜0.001，cg02744249 位 點P=0.001）。如圖2。

圖2 按控制情況分組后甲基化水平對比Fig.2 Differential methylation in different asthma control groups

2.4 肺功能相關性分析CTSZ啟動子中兩位點甲基化水平均與肺功能呈負相關，位點cg01623438中FEV1pred%及FEV1/FVC 相關系數(shù)分別為-0.706（P＜0.001）及-0.643（P＜0.001）；位點cg02744249中FEV1pred%及FEV1/FVC 相關系數(shù)分別為-0.692（P＜0.001）及-0.554（P=0.002）。見圖3。

圖3 肺功能相關性分析Fig.3 Correlation analysis of lung function

2.5 ROC曲線分析如圖4，cg01623438用于輔助哮喘診斷時AUC 為0.806（95%CI：0.683 ～0.896），cut-off 值為0.882 2，敏感性為100%，特異性為50%，P＜0.000 1；cg02744249 用于輔助哮喘診斷時AUC 為0.749（95%CI：0.620 ～0.852），cut-off 值為≤0.600 3，敏感性為43.3%，特異性為100%，P=0.000 1。當進行兩位點聯(lián)合分析時，如圖5 所示，AUC 為0.827（95%CI：0.707 ～0.912），cut-off值為≤0.460 3，敏感性為66.7%，特異性為83.3%，P＜0.000 1。

圖4 兩位點ROC 曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of two sites

圖5 兩位點聯(lián)合ROC 曲線分析Fig.5 ROC curve analysis of combined sites

3 討論

哮喘作為常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，目前診斷主要依賴于呼吸道癥狀及可變呼氣氣流受限的生理證據(jù)［16］。由于其癥狀表現(xiàn)較復雜，各地區(qū)中存在最高達70%的哮喘患者未被確診［17］。近年來DNA 甲基化研究理論及技術快速發(fā)展，為哮喘診治提供了新方向。目前已有較多基因及相關位點的甲基化被證明與哮喘發(fā)病相關。例如有研究對兒童哮喘病例進行全基因組甲基化測序分析，在哮喘兒童的不同組織樣本共尋找到多個與哮喘發(fā)病相關聯(lián)的甲基化位點及區(qū)域［18］。同時，甲基化改變也被證明與哮喘患者肺功能下降相關，并可將其用于肺功能不良和加速衰退期的臨床鑒別［19］。此外，也有學者發(fā)現(xiàn)母體哮喘可影響特定基因甲基化水平，增加子代哮喘的發(fā)生率［20］。以上研究說明，DNA 甲基化密切參與環(huán)境和遺傳這兩個引起哮喘發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，可能是哮喘診斷的潛在生物學標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)CTSZ 基因啟動子區(qū)域的兩個甲基化位點cg01623438 及cg02744249 在哮喘患者中均呈現(xiàn)低甲基化表達，并且在按哮喘控制情況進行分組后發(fā)現(xiàn)未控制組甲基化水平最低，隨控制情況改善而逐漸升高，提示CTSZ 基因在哮喘患者中存在差異性甲基化修飾，并且哮喘組甲基化程度受控制情況影響。哮喘患者目的位點甲基化水平與肺功能均呈負相關，結合其與控制情況關系可推測出在哮喘組中，甲基化水平降低指向不良預后，因此在臨床工作中，可對患者一段時期治療前后甲基化水平進行監(jiān)測，有助于客觀判斷此治療方案對患者的有效程度，以便于及時調整。ROC 曲線分析顯示，兩位點在單獨用于哮喘診斷時差異均有統(tǒng)計學意義，cg01623438 敏感性較高，而cg02744249 特異性較高，當結合兩位點后再次用于哮喘診斷時，總體敏感性及特異性均有改善，提示CTSZ 啟動子甲基化水平在哮喘診斷中具有一定價值。因此，綜上所述，筆者認為本研究中所涉及的CTSZ 啟動子區(qū)域兩個相關位點均與哮喘發(fā)病密切相關，且其可能是與肺功能改變相關的功能性位點，能較為客觀地反應哮喘患者肺功能水平。在用于哮喘診斷、用藥反應監(jiān)測、肺功能監(jiān)測等方面都有一定價值。

本研究是首次對CTSZ 基因啟動子甲基化與哮喘的關聯(lián)性進行分析，并且證明其在哮喘診斷及預后檢測中均具有一定價值。并且由于已有大量研究證實鼻黏膜細胞與支氣管上皮細胞在結構、功能、應激反應方面均有一定同一性［21-23］，因此本研究選取了更易被接受且快捷的鼻腔標本進行研究，為日后擴大研究數(shù)目提供可能。

但本研究尚不能說明甲基化改變是哮喘發(fā)生的原因還是結果，需要進一步的實驗驗證。此外，本研究納入樣本量較少，仍需繼續(xù)擴大樣本量驗證。

綜上，哮喘患者鼻腔細胞中CTSZ 啟動子區(qū)域發(fā)生低甲基化，且其甲基化程度與肺功能改變和控制狀態(tài)具有一定相關性，在用于哮喘診斷具有一定的敏感性及特異性，推測CTSZ 啟動子區(qū)甲基化檢測也許能夠作為一種輔助診斷和治療監(jiān)測的生物標志物，但仍需要進一步具體研究其相關機制。