丙泊酚預(yù)處理對膿毒癥大鼠認(rèn)知功能的影響

楊博 張茂芮 周軍

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科（四川瀘州646000）；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科（四川瀘州646000）

膿毒癥（sepsis）是以過度炎癥反應(yīng)為特征的一種疾病，其發(fā)展常以多器官衰竭和死亡為結(jié)局［1-2］。膿毒癥導(dǎo)致機(jī)體釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起難以控制的全身性炎癥反應(yīng)，發(fā)病率和病死率較高。近年來，學(xué)者提出膿毒癥會對大腦造成損傷，引發(fā)長期性的認(rèn)知功能障礙，影響患者的生活能力［3］。但目前對膿毒癥引起腦認(rèn)知功能障礙的具體機(jī)制不詳，也尚無明確治療手段。因此，研究膿毒癥所致認(rèn)知功能障礙的具體原因和機(jī)制，對防治腦損傷具有重要意義。丙泊酚是當(dāng)前臨床用鎮(zhèn)靜藥的代表，近年來，丙泊酚的抗炎和抗氧化應(yīng)激作用逐漸被大家關(guān)注［4-5］。大量研究證實(shí)，丙泊酚能夠阻止腫瘤壞死因子α對血腦屏障的破壞從而減輕中樞炎癥［6］，也能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，減輕缺血再灌注損傷［7］。但關(guān)于丙泊酚能否改善大鼠膿毒癥所致認(rèn)知功能障礙目前尚不清楚。本實(shí)驗擬研究丙泊酚在膿毒癥所致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生、發(fā)展過程中的調(diào)控作用，并探討其可能涉及的機(jī)制，為腦損傷的預(yù)防、治療提供更多的研究證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑、儀器戊巴比妥（浙江巨化集團(tuán)有限公司），丙泊酚注射液，批號：2007042（四川國瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司），白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α試劑盒（上海橋杜生物科技有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧化物（ROS）試劑盒（南京建成生物工程研究所），總RNA 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒（Takara，日本），TNF-α（#8184S）、IL-1β（#12703）、IL-6（#12153）（CST，美國），水迷宮（上海欣軟信息科技有限公司），電子光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），全光譜分光光度計（Thermo，美國），實(shí)時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad，美國）

1.2 實(shí)驗分組及制備模型由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供雄性成年SD 大鼠48 只（質(zhì)量為250 ～320 g）隨機(jī)分為四組，每組12只，分別為假手術(shù)組（Sham 組）、造模組（C 組）、低劑量丙泊酚預(yù)處理組［P1 組，丙泊酚5 mg/（kg·min）］以及高劑量丙泊酚預(yù)處理組［P2 組，丙泊酚10 mg/（kg·min）］。所有大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d，給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飲食。術(shù)前禁食12 h 但自由飲水。麻醉按照35 mg/kg 腹腔注射（戊巴比妥鈉：1%），P1 組和P2 組分別在造模前10 min 持續(xù)經(jīng)尾靜脈泵入丙泊酚注射液，Sham 組和C 組在同樣的時機(jī)給予等體積生理鹽水。通過盲腸結(jié)扎穿孔法（CLP）制備模型：經(jīng)正中開腹，充分暴露盲腸，用4-0 絲線結(jié)扎2/3 盲腸，用10 號針頭對盲腸腸壁經(jīng)行打孔，每孔相距3 mm，一共10孔。打孔完畢后輕擠盲腸使腸管內(nèi)糞便少量溢出，而后逐層縫合腹膜和皮膚。

1.3 水迷宮實(shí)驗每只大鼠在平臺上適應(yīng)環(huán)境30 s，然后面向池壁隨機(jī)放入水池的四個象限，讓其自由尋找平臺。如果在120 s 內(nèi)沒找到平臺，則人為引導(dǎo)其游向平臺并停留30 s 后重復(fù)實(shí)驗。每次給予4 min 間隔休息，每天訓(xùn)練3 次，連續(xù)進(jìn)行6 d。CLP 術(shù)后48 h 行水迷宮反轉(zhuǎn)實(shí)驗。該實(shí)驗中，與訓(xùn)練時不同的是：將平臺置于順時針旋轉(zhuǎn)180°的對面象限，開始對位訓(xùn)練。攝像系統(tǒng)跟蹤拍攝大鼠活動軌跡，記錄游泳距離和找到平臺耗費(fèi)的時間（潛伏期）并計算游泳速度［8］。

1.4 血清炎癥因子檢測經(jīng)心尖取血，在低溫高速離心機(jī)離心處理后取上層血清，參照既往文獻(xiàn)［9］，對IL-1β、IL-6 及TNF-α的表達(dá)量進(jìn)行檢測。

1.5 H&E 染色術(shù)后48 h 取材，經(jīng)多聚甲醛固定大腦標(biāo)本，包埋、切片等處理后進(jìn)行H&E 染色。高倍鏡下（400 ×）觀察各切片相同部位的細(xì)胞形態(tài)，隨機(jī)選擇額葉皮質(zhì)和海馬CA1 區(qū)的10 個視野拍照并計數(shù)正常神經(jīng)元數(shù)量。

1.6 腦組織炎癥反應(yīng)測定術(shù)后48 h取額葉皮質(zhì)、海馬CA1 區(qū)腦組織，通過Trizol 法提取總RNA。采用TAKARA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)IL-1β、IL-6 及TNF-α目的基因序列設(shè)計并合成引物，引物序列如下：IL-1β上引物：5′-CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3′，下引物：3′-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-5′；IL-6 上引物：5′-CCAAGACCATCCAACTCATCTTG-3′，下引物：3′-CACAGTGAGGAATGTCCACAAAC-5′；TNF-α 上引物：5′-CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA-3′，下引物：3′-CTCCTGGTATGAAATGGCAAATC-5′；GAPDH 上引物：5′-GATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′，下引物：3′-ATGAAGGGGTCGTTGATGG-5′。采用TAKARA 實(shí)時熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 檢測，檢驗引物的溶解曲線，分析各組目的基因的ΔCT值，采用2-ΔΔCT法計算基因表達(dá)量。將各腦區(qū)腦組織在冰上研磨后提取蛋白并采用BCA 定量。通過Western blot 法檢測IL-1β、IL-6 及TNF-α的蛋白表達(dá)。取各組蛋白樣品，經(jīng)過電泳轉(zhuǎn)膜和封閉后加入一抗（IL-1β、IL-6 及TNF-α）過夜，洗膜后孵育二抗并顯色，進(jìn)行定量分析。

1.7 MDA、SOD 和ROS 活性測定參照既往文獻(xiàn)［9］，在低溫下制取額葉皮質(zhì)和海馬組織勻漿，低溫離心15 min 后取上清。依照試劑盒說明書，分別對丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及活性氧化物（ROS）的表達(dá)水平進(jìn)行測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，研究數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。分析方法采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 法分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚減輕膿毒癥所致腦損傷假手術(shù)組額葉皮質(zhì)和海馬CA1 區(qū)的細(xì)胞未見異常（圖1）。C組大鼠相應(yīng)腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞體積縮小，正常神經(jīng)元數(shù)量減少明顯。高、低劑量丙泊酚預(yù)處理組異常神經(jīng)元數(shù)量低于C 組，腦組織形態(tài)改變明顯減輕，相較于P1 組，P2 組對應(yīng)腦區(qū)的異常改變明顯更?。‵皮質(zhì)= 110.7，P皮質(zhì)＜0.01；F海馬=105.4，P海馬＜0.01）。實(shí)驗結(jié)果證明丙泊酚能夠減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，保護(hù)腦組織。

圖1 腦組織H&E 染色（×400）Fig.1 H&E staining images of brain（×400）

2.2 丙泊酚改善膿毒癥大鼠的認(rèn)知功能障礙術(shù)前連續(xù)訓(xùn)練中，各組大鼠的平均游泳距離和潛伏期隨著訓(xùn)練時間的增加逐漸縮短，游泳速度無明顯差異。反轉(zhuǎn)實(shí)驗中，與Sham 組相比，C 組游泳距離和潛伏期明顯增加，在平臺所在象限活動的距離和時間明顯縮短（P＜0.01）；P2 組相較于C 組，其游泳距離和潛伏期則顯著縮短，在平臺所在象限活動的距離和時間明顯縮短（P＜0.01）；每組大鼠的游泳速度無明顯差異，見表1、圖2。

2.3 丙泊酚抑制膿毒癥大鼠的血清及腦組織的炎癥反應(yīng)相較于Sham 組，C 組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量以及額葉皮質(zhì)和海馬CA1 區(qū)的IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA 和蛋白表達(dá)顯著增加；與C 組相比，丙泊酚預(yù)處理組大鼠的血清和對應(yīng)腦區(qū)的上述炎癥因子表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05，見表2、圖3）。

表1 水迷宮實(shí)驗Tab.1 Morris water maze test ±s

表1 水迷宮實(shí)驗Tab.1 Morris water maze test ±s

注：*P ＜0.05，**P ＜0.01 vs. Sham 組；NSP ＞0.05，#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs.C 組

?

圖2 水迷宮實(shí)驗Fig.2 Morris water maze test

2.4 丙泊酚減輕膿毒癥大鼠腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)相較于Sham 組，C 組、P1 組、P2 組額葉皮質(zhì)和海馬CA1 區(qū)的MDA 和ROS 水平明顯升高，SOD 活性明顯降低（P＜0.01）；與C 組相比，P1 組的上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而P2 組大鼠對應(yīng)腦區(qū)的MDA 和ROS 水平明顯降低，SOD 活性明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

表2 炎癥反應(yīng)Tab.2 Inflammatory response ±s

表2 炎癥反應(yīng)Tab.2 Inflammatory response ±s

注：Gapdh 為內(nèi)參，*P ＜0.05，**P ＜0.01 vs.Sham 組；##P ＜0.01 vs.C 組

?

圖3 炎癥反應(yīng)Fig.3 Inflammatory response

圖4 腦組織的氧化應(yīng)激改變Fig.4 Oxidative stress changes in brain tissue

3 討論

本研究采用大鼠盲腸結(jié)扎穿孔復(fù)刻膿毒癥模型，探究丙泊酚在膿毒癥所致腦損傷中的腦保護(hù)作用。Morris 水迷宮是認(rèn)知功能評價的經(jīng)典研究方法［10］，因此本研究選用Morris 水迷宮對實(shí)驗大鼠的認(rèn)知功能進(jìn)行評估。水迷宮實(shí)驗中，術(shù)后48 h檢測發(fā)現(xiàn)造模組大鼠的游泳距離和潛伏期明顯增長，說明膿毒癥大鼠發(fā)生了認(rèn)知功能障礙，與前人研究一致，證實(shí)建模成功［11］。不同劑量丙泊酚預(yù)處理后大鼠的游泳距離和潛伏期縮短，加上平臺所在象限的活動結(jié)果，說明丙泊酚預(yù)處理能有效緩解膿毒癥所致腦損傷。

目前對膿毒癥所致腦認(rèn)知功能障礙的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥造成的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激與腦組織神經(jīng)元的損傷密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)血清及腦組織勻漿中IL-1β、TNF-α、IL-6 的表達(dá)顯著增加，腦組織中MDA、ROS 增加，而SOD 活性下降，證明膿毒癥引起了全身及腦組織炎癥反應(yīng)和腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。組織學(xué)染色結(jié)果也顯示膿毒癥導(dǎo)致大鼠額葉皮質(zhì)以及海馬CA1 區(qū)的損傷神經(jīng)元明顯增多，表現(xiàn)為細(xì)胞核深染呈固縮、碎裂相，與以往實(shí)驗結(jié)果類似［12-13］。本實(shí)驗采用丙泊酚預(yù)處理后，腦組織炎癥因子降低、氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕、損傷神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，與丙泊酚改善實(shí)驗大鼠認(rèn)知功能結(jié)果一致，證明丙泊酚預(yù)處理可減輕血清及腦組織中炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善膿毒癥所致的認(rèn)知功能障礙。

丙泊酚是一種持續(xù)泵注無蓄積的靜脈鎮(zhèn)靜藥，其非麻醉效應(yīng)如抗炎、抗氧化、抗焦慮、減輕惡心嘔吐等作用也受到關(guān)注［14-16］。目前許多研究已證實(shí)丙泊酚能夠抑制在體或體外的炎癥反應(yīng)。SOUSA 等［17］發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以通過改變炎性細(xì)胞的趨化和吞噬功能，抑制炎癥因子分泌，調(diào)控氧化亞氮水平等方面調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)往往伴隨產(chǎn)生，二者相互促進(jìn)。HALLADIN［18］提出丙泊酚可以通過抑制氧自由基的產(chǎn)生而減輕機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時還能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的平衡而抑制炎癥反應(yīng)等機(jī)制對多種器官的損傷發(fā)揮保護(hù)作用。此外，ZHENG 等［19］研究表明，丙泊酚能抑制脂質(zhì)過氧化以及清除自由基，從而調(diào)控下游信號，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示丙泊酚預(yù)處理可減輕膿毒癥大鼠血清和腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量，表明丙泊酚具有較強(qiáng)的抗炎作用。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，丙泊酚能夠明顯減少M(fèi)DA 的產(chǎn)生，增加SOD 的活性，減少ROS 含量，這說明外源性給予丙泊酚能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用［20-22］。

本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥導(dǎo)致大鼠認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)元損傷及神經(jīng)炎癥反應(yīng)。參照既往國內(nèi)外文獻(xiàn)，本研究采用不同劑量的丙泊酚干預(yù)，結(jié)果表明不同劑量的丙泊酚預(yù)處理均能改善膿毒癥所致認(rèn)知功能障礙。其可能機(jī)制為：（1）減少神經(jīng)炎癥因子產(chǎn)生；（2）抑制中樞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但其具體通過哪些信號通路及相關(guān)途徑調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)尚需要深入研究。后續(xù)研究將著重探究膿毒癥對腦損傷的機(jī)制，以及丙泊酚在減輕膿毒癥所致認(rèn)知功能障礙過程中的分子機(jī)制和作用靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究證實(shí)了丙泊酚對膿毒癥所致大鼠認(rèn)知功能障礙具有防治作用，其機(jī)制可能與丙泊酚的抗炎和抗氧化作用相關(guān)，具有一定的理論基礎(chǔ)研究價值，為治療膿毒癥腦損傷提供了一種新思路。