超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中洛克沙胂、阿散酸和硝苯砷酸

李 蕊 李韶聰 金慧然 王鏨彧 宋 麗 陶 婭

（黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品和獸藥飼料技術(shù)鑒定站，哈爾濱150036）

有機砷制劑是畜禽生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的飼料添加劑，其種類主要有洛克沙胂、阿散酸、硝苯砷酸等，具有抗菌、抗球蟲、促進蛋白質(zhì)合成、提高飼料利用率、改善產(chǎn)品外觀等作用[1～2]。長期、大量使用有機砷制劑可導致過量的砷蓄積在畜禽體內(nèi)，造成器官組織功能紊亂和器質(zhì)性病變，表現(xiàn)為中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，視神經(jīng)萎縮，甚至失明。另外，有機砷不易被機體吸收，大部分以原形隨排泄物進入生態(tài)環(huán)境，污染水體和土壤，通過食物鏈的蓄積可對人類健康造成巨大影響[3～4]。歐盟和美國早已宣布禁止洛克沙胂和阿散酸的使用，我國農(nóng)業(yè)部第2638號公告規(guī)定[5]，自2019年5月1 日起，禁止使用洛克沙胂、阿散酸的原料藥及各種制劑。為了確保飼料及動物性食品安全，維護公共衛(wèi)生和生態(tài)安全，建立飼料中有機砷的檢測方法以監(jiān)控其非法添加勢在必行。

迄今為止，國內(nèi)外對有機砷制劑的檢測主要采用氣相色譜法[6]、高效液相色譜法[7～8]、高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9～10]，而采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測有機砷制劑的報道很少[11]，未見關(guān)于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測飼料中3種有機砷制劑的報道。本研究探討建立采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中阿散酸、硝苯砷酸、洛克沙胂的方法。

一、材料與方法

（一）儀器與材料

1.儀器。超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（QTRAP 4500 型，AB Sciex 公司，美國）； 電子天平 （0.01mg，METTLER 公司，瑞士）； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （Heidolph 公司，德國）； 高速離心機 （Sigma公司，德國）； 渦旋混合儀（IKA 公司，德國）。

2.試劑與藥品。甲醇、乙腈、甲酸 （色譜純，J.T.Baker 公司）； 水為超純水； 10%甲醇水溶液；1%甲酸水－乙腈溶液 （25∶75，V∶V）： 取1.0 mL 甲酸加入到99 mL 75%乙腈水溶液中； 洛克沙胂 （含量99.0%）、阿散酸 （含量99.0%）和硝苯砷酸（含量99.0%）標準品 （Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，德國）。

（二）實驗方法

1.標準溶液配制。精密稱取3 種有機砷制劑對照品各10 mg，置于3 個100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得終濃度為100 μg/mL 的標準儲備液，置于－20℃冰箱中保存6 個月，臨用前用10%甲醇水溶液稀釋成所需濃度的標準工作溶液。

2.樣品處理。稱取飼料樣品2.00（±0.02）g 于50 mL 離心管中，加入10 mL 1%甲酸水－乙腈（25∶75，V∶V）超聲提取10 min，中間手動振搖2 次，10000 r/min 離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，重復(fù)提取1 次，合并上清液，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至＜3 mL，用10%甲醇水溶液定容至5 mL，6000 r/min 離心10 min，上清液過0.22 μm 濾膜后，供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.色譜條件。色譜柱為phenomenex KinetexF5色譜柱（3.0 mm×50 mm，2.6 μm，美國Phenomenex公司）； 流動相A 為0.1%甲酸乙腈，流動相B 為0.1%甲酸水； 流速為0.4 mL/min； 進樣量為5 μL；柱溫40℃。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

4．質(zhì)譜條件。電噴霧離子源； 掃描方式為正、負離子同時掃描 （ESI±）； 檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）； 電噴霧電壓（IS）為5500 V； 霧化氣壓力（GS1）為50 psi； 氣簾氣壓力（CUR）為30 psi； 輔助氣流速（GS2）為60 psi； 離子源溫度500℃； 碰撞氣（CAD），Medium。離子參數(shù)見表2。

表2 有機砷制劑特征離子質(zhì)譜條件

二、結(jié)果與分析

（一）標準曲線與線性范圍精密量取3 種有機砷制劑標準工作液適量，添加到空白樣品中，制得 阿 散 酸 和 洛 克 沙 胂 濃 度 為5.0、10、20、50、100、200 μg/kg 的各系列空白添加試料； 制得硝苯砷酸濃度為50、100、200、500、1000、2000 μg/kg的各系列空白添加試料，樣品處理后，上機測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積y為縱坐標，各系列空白添加的濃度X為橫坐標，繪制標準曲線 （見表3）。

表3 3 種有機砷制劑的標準曲線和相關(guān)系數(shù)

（二）檢出限與定量限用空白飼料樣品進行添加試驗，以3 倍信噪比（S/N≥3）測得洛克沙胂、阿散酸的檢出限為5.0 μg/kg，硝苯砷酸的檢出限為50.0 μg/kg； 以10 倍信噪比 （S/N≥10）測得阿散酸、洛克沙胂的定量限為10.0 μg/kg，硝苯砷酸的定量限為100.0 μg/kg?？瞻罪暳咸砑勇蹇松畴稀⑸⑺?、硝苯砷酸標準溶液特征離子質(zhì)量色譜圖如圖1 所示。

（三）準確度與精密度空白飼料樣品中添加標準工作溶液，阿散酸和洛克沙胂添加濃度為10、20、40 μg/kg，硝苯砷酸的添加濃度為100、200、400 μg/kg，每個濃度做6 個平行樣品，重復(fù)3 次，按照樣品處理方法制備樣品溶液，回收率及精密度見表4 和表5。

三、討論

（一）提取溶劑的選擇有機砷制劑易溶于甲醇、乙醇、乙腈和熱水中，參考相關(guān)文獻資料，分別比較了甲醇和水、乙腈和水、磷酸氫二鉀作為提取溶液時的提取效率，結(jié)果表明，提取液中含有大比例水相時回收率只有20%～30%，提取液中含有大比例有機相時回收率明顯升高，而且大比例的乙腈能使樣品中的蛋白質(zhì)變性沉淀，可減少雜質(zhì)干擾。比較不同比例的乙腈－水 （50∶50、75∶25、90∶10，V∶V），以乙腈－水（75∶25，V∶V）提取回收率最高，而加入0.1%甲酸、0.5%甲酸、1%甲酸、2%甲酸，經(jīng)過上機檢測，采用1%甲酸水－乙腈 （25∶75，V∶V）時，回收率達到60%～80%，色譜圖良好。

圖1 空白飼料添加3 種有機砷制劑標準溶液特征離子質(zhì)量色譜圖

表4 阿散酸、洛克沙胂的回收率及精密度 （n＝6，%）

表5 硝苯砷酸的回收率及精密度 （n＝6，%）

（二）提取方法的選擇常見的飼料中藥物提取方法有振蕩、渦旋和超聲法，前兩者通常需要較長的時間，本實驗選擇超聲處理，將提取程序所需時間縮短到10 min，且能得到滿意的回收率。

（三）分離條件的優(yōu)化通過調(diào)節(jié)流動相的組成、梯度、pH 值、選擇適宜的色譜柱來獲得最佳的色譜分離條件。選用waters BEH C18 柱時，各化合物不能達到基線分離，本研究選用phenomenex KinetexF5 色譜柱，各目標化合物的分離度良好； 在流動相中加入0.1%甲酸獲得了更加穩(wěn)定和對稱的峰形。

四、結(jié)論

本試驗建立了同時檢測飼料中洛克沙胂、阿散酸和硝苯砷酸的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法，操作簡單，色譜條件易掌握且重復(fù)性好。洛克沙胂和阿散酸的平均加標回收率在62.7%～81.7%，RSD≤15%； 硝苯砷酸的平均加標回收率為72.5%～83.3%，RSD≤15%，方法的準確度、精密度和靈敏度都能滿足分析要求，對測定飼料中的有機砷制劑有很好的適用性。