固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測牛奶中地塞米松殘留

任宏彬 花 錦 楊蒲晨 楊曉偉 賈曉婷 張志華

（太原海關技術中心，太原030024）

地塞米松是一種人工合成的皮質(zhì)類固醇，具有消炎、抗病毒、促進泌乳等多種功效，在養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用，造成不同程度藥物殘留，人體攝入過量可能會引起激素代謝紊亂、肥胖、骨質(zhì)疏松等病癥，并可能產(chǎn)生致畸、致癌等風險[1～5]。根據(jù)我國GB 31650－2019 《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》 規(guī)定，地塞米松在牛奶中的最大殘留限量為0.3 μg/kg[6]。因此，為保障牛奶飲用安全，有必要建立一種安全、有效地分析牛奶中地塞米松殘留的方法。

目前，地塞米松檢測手段主要包括酶聯(lián)免疫法[7]、氣相色譜法[8～9]、氣相色譜－質(zhì)譜法[10]、液相色譜法[11～12]和液相色譜－質(zhì)譜法[13～14]等。其中，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法因其具有靈敏度高、特異性強、分析速度快等優(yōu)點，成為獸藥殘留檢測最有效的方法，被廣泛應用于牛奶中地塞米松殘留的檢測[15～18]。本文基于農(nóng)業(yè)部1031號公告－2－2008 《動物源性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留檢測 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法》[19]，通過簡化色譜條件，對比兩種樣品前處理方法的提取效果，改進標準曲線的繪制方式，旨在建立一種安全、高效、穩(wěn)定的檢測牛奶中地塞米松殘留的方法，為相關研究提供借鑒。

一、材料與方法

（一）材料與試劑學生飲用奶，大同市牧同乳業(yè)有限公司； 地塞米松標準品 （純度98.7%），Bepure 公司； 甲醇、正己烷、乙酸乙酯 （色譜純），北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心； 丙酮 （分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司； Silica 固相萃取柱（500 mg/3 mL）、有機濾膜 （0.22 μm），上海安譜實驗股份科技有限公司。

（二）儀器與設備LC-30AD 高效液相色譜，LCMS-8050 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 （配有電噴霧離子源ESI），日本Shimadzu 公司； ST40R 高速冷凍離心機，美國Thermo 公司； vortex genie 2 渦旋混合器，美國SI 公司； LE244S 電子天平，德國Sartorius 公司。

（三）試驗設計

1.標準溶液的配制。準確稱取地塞米松標準品用甲醇溶解配制成濃度為100 μg/mL 的標準貯備液。稱取5 份陰性牛奶樣品2.00 g，分別準確加入稀釋后的標準貯備液，按照下文步驟進行樣品前處理，以最終定容體積得到濃度為1、2、5、10、50 ng/mL 的標準工作液。

2.樣品前處理。（1）提取。稱取牛奶樣品2.00 g 于50 mL 聚丙烯離心管中，加10 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，超聲提取10 min，以8000 r/min離心5 min，移取上層乙酸乙酯，在40℃水浴下氮氣吹干，加3 mL 乙酸乙酯－正己烷（1∶5，V∶V）振蕩溶解殘渣，待凈化。（2）凈化。將溶解液轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上 （使用前以3 mL 正己烷進行活化），自然流干，以3 mL 正己烷淋洗，抽干。加3 mL 正己烷－丙酮（6∶4，V∶V）洗脫，收集洗脫液，在40℃水浴下氮氣吹干，以20%乙腈水溶液定容至1 mL，過濾膜后待上機分析。

3.色譜條件。色譜柱為Shim-pack GIST C18（100×2.1 mm，2 μm）； 柱流量為0.3 mL/min； 柱溫40℃； 流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，等度洗脫，流動相比例A∶B 為50∶50；進樣體積為10 μL。

4.質(zhì)譜條件。掃描方式為負離子掃描； 接口電壓4.0 kV； 霧化氣為氮氣，3 L/min； 加熱氣流量為10 L/min； DL 溫 度 為250℃； 加 熱 塊 溫 度 為400℃； 碰撞氣為氬氣，270 kPa； 檢測方式為多反應檢測（MRM）模式。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 MRM 質(zhì)譜參數(shù)

二、結果與討論

（一）色譜條件的優(yōu)化農(nóng)業(yè)部1031號公告－2－2008 標準[19]中通過3 種流動相 （水－乙腈－甲酸水）對多種糖皮質(zhì)激素類藥物進行梯度洗脫?？紤]到本試驗僅需檢測地塞米松，因此，簡化為2種流動相0.1%甲酸水－乙腈 （50∶50，V∶V）進行等度洗脫，結果如圖1 所示，在此條件下，目標物在2 min 前出峰，峰型良好，有效節(jié)約了分析時間。

（二）質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化以5 ng/mL 地塞米松進行掃描，對其母離子、子離子、碰撞能量等條件進行優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子強度達到最大，選擇豐度最高的碎片離子作為定性與定量特征離子，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

圖1 5 ng/mL 地塞米松的總離子流色譜圖

（三）前處理方法的對比驗證據(jù)文獻報道，正己烷脫脂法[20]是將待凈化濾液以正己烷脫脂，定容過膜后上機檢測，相較于固相萃取法，在保證檢測結果準確性的前提下，可有效節(jié)約樣品前處理時間和試驗成本。為驗證正己烷脫脂法和固相萃取法的差異，選取陰性牛奶樣品，在加標濃度5 μg/kg下，分別按照文獻中的正己烷脫脂法和本試驗中的固相萃取法對樣品進行前處理后上機檢測，結果如圖2 所示。

圖2 兩種前處理方法加標檢測結果質(zhì)譜圖對比

由圖2 中2 種前處理方法加標檢測結果質(zhì)譜圖對比可知，在相同加標濃度下，正己烷脫脂法檢測結果存在明顯的雜峰干擾，且目標峰強度相對較低； 而固相萃取法檢測結果目標峰峰型尖銳對稱，響應強度高，雜峰干擾小，更有利于定量分析。另外，在前處理過程中發(fā)現(xiàn)，正己烷脫脂法在脫脂后，濾液呈白色渾濁狀態(tài)，過濾膜時阻力較大，說明存在大顆粒雜質(zhì)，上機液呈白色半透明狀，存在阻塞管路、污染離子源的可能； 而固相萃取法定容后的濾液和過濾膜后的上機液均澄清透明，更有利于對儀器的保護。雖然正己烷脫脂法可在一定程度上節(jié)約時間和試驗成本，但從峰型、響應強度和儀器安全風險角度考慮，選擇固相萃取法更為可靠。

（四）標準曲線繪制和精密度試驗在痕量分析中，樣品前處理過程常常伴隨著目標物的損失，影響分析結果的準確性，同位素內(nèi)標法[21]可有效降低這一影響，但同位素內(nèi)標往往價格昂貴，大幅提高了試驗成本。因此，采用兩種方式進行定量。方式1 采用外標法，參考農(nóng)業(yè)部1031號公告－2－2008 標準[19]要求，準確移取地塞米松標準儲備液，以20%乙腈水溶液稀釋，配制成濃度為1、2、5、10、50 ng/mL 的系列濃度標準工作液； 方式2 采用標準加入法，按照本試驗所述標準溶液的配制步驟操作。將兩組標準工作液上機檢測，以目標化合物峰面積（Y）與濃度（X）進行線性回歸，繪制標準曲線，結果見表2。

表2 地塞米松的兩種標準曲線繪制方式的線性回歸方程

由表2 可知，兩種標準曲線繪制方式的線性關系良好，但各濃度點峰面積差別較大，方式1 是方式2 對應標準濃度點峰面積的3～5 倍，表明受樣品前處理過程的影響，目標物損失較為明顯。為進一步驗證兩種標準曲線繪制方式的適用性，在線性范圍內(nèi)選擇0.5、2.5、5.0 μg/kg 水平加標濃度（每個濃度點平行測定6 次），按照本試驗所選擇的固相萃取法進行前處理后上機檢測，分別代入上述兩條標準曲線進行線性擬合，考查回收率和相對標準偏差，結果見表3。

表3 地塞米松在三水平加標濃度下的回收率及精密度 （%）

由表3 可知，3 水平加標檢測結果代入方式1所繪制的標準曲線中，平均回收率＜20%，RSD＞10%，無法滿足實驗要求； 代入方式2 所繪制的標準曲線中，平均回收率在65.7%～85.7%，RSD＜10%，滿足農(nóng)業(yè)部1031號公告－2－2008 標準[19]中關于地塞米松在牛奶樣品中的回收率 （50%～120%）及精密度（＜20%）要求。因此，選擇標準加入法定量結果更為準確。

（五）方法定量限和檢出限準確移取稀釋后的地塞米松標準貯備液逐級遞減添加到空白樣品中，按照上文選擇的固相萃取法和條件進行處理和分析，以10 倍信噪比作為定量限，如圖3 所示，加標濃度為0.25 μg/kg 可作為地塞米松在牛奶中的定量限，依據(jù)定量限為3 倍檢出限原則，得到方法檢出限約為0.08 μg/kg，滿足農(nóng)業(yè)部1031號公告－2－2008 標準[19]中關于地塞米松在牛奶樣品中的靈敏度（定量限0.2 μg/L）要求。

圖3 牛奶中地塞米松加標濃度為0.25 μg/kg 時檢測結果質(zhì)譜圖

（六）樣品檢測抽取當?shù)刂行W的牛奶樣品14 份，采用本方法對其地塞米松殘留進行測定，與農(nóng)業(yè)部1031號公告－2－2008 標準[19]中的檢測方式和定量方法相比，可有效節(jié)約試驗成本，提高分析準確度。結果均未檢出地塞米松殘留，滿足食品安全國家標準關于牛奶中地塞米松最大殘留限量的要求。

三、結論

本研究通過簡化農(nóng)業(yè)部1031號公告－2－2008標準[19]中的流動相組合，縮短分析時間，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，對比兩種樣品前處理方法，改進標準曲線繪制方式，建立了檢測牛奶中地塞米松殘留的固相萃?。咝б合嗌V－質(zhì)譜聯(lián)用分析方法。該方法經(jīng)濟、簡便、可靠，能夠滿足實驗室對批量牛奶樣品中地塞米松殘留的檢測要求。