嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑在葡萄和土壤中的殘留消解動態(tài)及風險評估

劉 茜 張 憲 陳 敏 尹 全 楊曉鳳

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，成都610066； 2.中國綠色食品發(fā)展中心，北京100081）

葡萄屬于漿果族水果，其豐富的營養(yǎng)價值頗受消費者的喜愛[1]。葡萄皮含有豐富的天然色素和白藜蘆醇等抗氧化物質，不但對人體內(nèi)糖類的分解有積極的促進作用，且有助于抵抗和預防皮膚癌[2]。葡萄中富含花青素和類黃酮，這兩類物質都是強力抗氧化劑，可以減少皮膚上產(chǎn)生皺紋和緩解老年人視力退化[3]。葡萄籽含有多酚類、油脂類、氨基酸、維生素和礦物質等物質，防治過敏、癌癥、衰老等疾病[4]。葡萄是世界上產(chǎn)量最大的水果之一[5]。在葡萄的生長過程中，灰霉病嚴重影響其產(chǎn)量和品質，為此，我國從國外引進嘧菌環(huán)胺和異菌脲，廣泛應用于防治葡萄灰霉病[6]，并已制定葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的最大殘留限量 （MRL）分別為20 mg/kg 和10 mg/kg[7]。

嘧菌環(huán)胺和異菌脲（結構式見圖1）[8]均屬于殺菌劑，單劑已在番茄、蘋果、葡萄、人參、黃瓜、辣椒、馬鈴薯、西瓜、香蕉、小油菜進行了農(nóng)藥殘留登記，但兩種復配劑尚未登記[9]。目前對嘧菌環(huán)胺在人參、柑橘、草莓上的藥效試驗，病菌的敏感性試驗和動態(tài)消解及膳食風險評估試驗已有研究[10～12]，對異菌脲在楊梅等作物上也有不同方向的研究[13]，但對兩種農(nóng)藥在葡萄和土壤中的殘留消解及風險評估尚未見探究。本文于2016－2017 兩年分別在遼寧省和四川省在良好農(nóng)業(yè)規(guī)范 （good agricultural practices，GAP）條件下開展60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑在葡萄和土壤中的田間試驗，且在良好實驗室規(guī)范 （good laboratory practice，GLP）條件下分析兩地葡萄和土壤的殘留消解規(guī)律并進行風險評估，旨在為嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)，同時也為關注嘧菌環(huán)胺和異菌脲在土壤環(huán)境中的殘留趨勢提供參考。

圖1 嘧菌環(huán)胺（a）和異菌脲（b）化學結構式

一、材料與方法

（一）試劑及儀器

1.試劑。嘧菌環(huán)胺、異菌脲標準品 （純度99.96%、99.82%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司），丙酮、甲苯、乙腈 （色譜純，美國Fisher 公司），氯化鈉 （分析純，上海中化試劑公司），石墨化碳－氨基復合柱（500 mg/6 mL，DIKMA 公司）。

2.儀器。氣相色譜－串聯(lián)質譜儀（SHZMADZU TQ－8040），配有三重四極桿質量分析器，HP－5MS （0.25 μm×30 m×0.25 mm）色譜柱，多反應監(jiān)測模式 （multiple reaction monitoring，MRM），日本島津公司； 高速勻漿機 （IKA－T18 basic，德國IKA 公司)、旋轉蒸發(fā)儀 （Rotavapor R－210，瑞士BUCHI 公司）、多功能食品料理機 （博朗3205，德國BRAUN 公司）。

（二）田間試驗本研究的田間試驗分為消解動態(tài)和最終殘留試驗兩部分。試驗于2016－2017兩年分別在遼寧省沈陽市太子河區(qū)東寧衛(wèi)鄉(xiāng)和四川省成都市龍泉驛區(qū)山泉鎮(zhèn)進行。田間試驗方案根據(jù)《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標準操作規(guī)程》[14]和NY/T 788－2004 《農(nóng)藥殘留試驗準則》[15]設計。遼寧省和四川省供試作物及其品種分別是葡萄“貝達” 和葡萄 “巨峰”，被試物60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑由山東億嘉農(nóng)化有限公司提供。

1.消解動態(tài)試驗。葡萄： 以制劑500 倍液（有效成分1200 mg/kg）于葡萄果實為成熟期1/2 大小時施藥，小區(qū)面積30 m2，重復處理3 次，處理間設保護間隔區(qū)，另設清水空白對照。土壤： 選一塊10 m2的土地單獨施藥，施藥濃度為1000 g a.i./hm2（制劑0.17 g/m2），施藥次數(shù)1 次，另設清水空白對照。葡萄和土壤均施藥后2 h 和1、3、5、7、10、14、21、28、35 d 采樣。

2.最終殘留試驗。葡萄： 根據(jù)收獲期向前推算確定施藥時期，兩個施藥劑量，低劑量制劑1000倍液（有效成分600 mg/kg），高劑量制劑666.7 倍液（有效成分900 mg/kg）。低劑量和高劑量各設2次和3 次施藥處理，每個處理3 次重復，小區(qū)面積30 m2，施藥間隔期7 d，末次施藥后間隔7、14、21 d 采集樣品。另設清水空白對照，處理間設保護帶。土壤： 土壤的施藥時間、施藥量和小區(qū)面積與葡萄一致。

3.樣品采集制備與保存。葡萄： 用隨機方法在試驗小區(qū)內(nèi)上、下、左、右不同部位采集6 串以上生長正常、無病害、確已著藥、成熟的葡萄果實，每小區(qū)采集葡萄樣本不少于2 kg，裝入樣本容器中包扎妥當，8 h 內(nèi)運回實驗室，用多功能食品加工機搗碎成漿液，混合均勻后，分取150 g 兩份，裝入樣品盒密封，貼好標簽后立即放于－20℃冰柜中保存。土壤： 在試驗小區(qū)內(nèi)葡萄樹冠下，用土鉆隨機采取0～15 cm 土壤樣本，采樣6～12 點，每小區(qū)每次采樣不少于2 kg，裝入樣本容器中包扎妥當，8 h 內(nèi)運回實驗室，碾碎，過篩，混勻縮分后保留200 g 左右兩份，分別裝入可封口的樣品袋中，貼好標簽后立即將樣品放于－20℃冰箱中保存。

（三）分析方法

1.前處理。（1）提取。稱取10 g（精確至0.001 g）葡萄和土壤試樣于50 mL 離心管中，準確加入20.0 mL 乙腈，15000 r/min 高速勻漿2 min，濾液全部過濾到裝有3～5 g NaCl 的50 mL 比色管中，蓋上塞子，振蕩1 min，在室溫下靜置1 h，待乙腈相和水相分層。準確吸取10.0 mL 上清液于10 mL比色管中，待凈化。（2）凈化。用5 mL 乙腈+甲苯（3∶1，V∶V）預淋活化石墨化碳/ 氨基復合柱，待柱液面近干時，將上述待凈化溶液轉入小柱中，開始收集，再用15 mL 乙腈+甲苯 （3∶1，V∶V）淋洗，收集洗脫液于150 mL 濃縮瓶中，濃縮，用正己烷+丙酮 （9∶1，V∶V）定容至5 mL，裝瓶，部分樣品上機濃度根據(jù)標準曲線濃度稀釋相應倍數(shù)后，待GC－QqQ－MS/MS 測試。

2.GC－QqQ－MS/MS 檢測條件。色譜升溫程序： 初始溫度150℃，以10℃/min 升至260℃，再以20℃/min 升至300℃，保持2 min； 載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min； 進樣口溫度60℃； 進樣量1 μL； 進樣方式為不分流進樣； 電子轟擊源70 eV； 離子源溫度230℃； GC－MS 接口溫度300℃；監(jiān)測參數(shù)見表1。

3.標準工作曲線。分別稱取一定量的嘧菌環(huán)胺和異菌脲，用丙酮稀釋為1000 mg/L 標準儲備液，置于0℃以下冰柜貯存待用； 用丙酮稀釋標準儲備液至100 mg/L，然后分別用葡萄和土壤的空白基質溶液逐級稀釋至0.010、0.050、0.10、0.20、0.50 mg/L 的混合標準溶液，按照上文的檢測條件上機測試，分別以嘧菌環(huán)胺和異菌脲的質量濃度（x，mg/L）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，繪制葡萄和土壤的標準曲線。

4.添加回收試驗。在葡萄空白對照樣品中添加0.010、0.20、2.5 和20 mg/kg （10 mg/kg）4 個不同濃度的嘧菌環(huán)胺和異菌脲，在土壤空白對照樣品中添加0.010、0.20 和2.5 mg/kg 3 個不同濃度的嘧菌環(huán)胺和異菌脲進行添加回收試驗，每個添加水平做5 個平行，分別計算平均值和相對標準偏差（RSD%）。

表1 嘧菌環(huán)胺和異菌脲的GC-QqQ-MS/MS 參數(shù)

（四）消解動力學根據(jù)文獻報道，消解速率可利用一級動力學模式進行評價，公式即Ct＝C0e－kt[16]，t（d）表示樣品的采收間隔期，Ct（mg/kg）代表在t時采收樣品中的農(nóng)藥殘留量，C0（mg/kg）是原始沉積量，k表示消解速率。公式中C0用2 h的殘留量進行分析，DT50代表農(nóng)藥消解半衰期，根據(jù)DT50＝ln2/k 計算。

（五）風險評價農(nóng)藥的風險評價指標很多，本文中選擇兩種指標，一種是利用農(nóng)藥的膳食暴露健康風險危害指數(shù) （HI），其用農(nóng)藥的每日膳食暴露量（EDI）與每日允許攝入量（ADI）的比值危險商（HQ）判斷； 另一種是對農(nóng)藥的長期攝入量膳食風險商 （RQ）進行評價。當HI、HQ和RQ均小于100%，則代表風險是可接受的，相反則會對人類健康存在潛在的風險。

公式 （1）中，EDI（mg/kg d）為每日膳食暴露 量；C（mg/kg）為 樣 品 中 農(nóng) 藥 殘 留 量；Fi（kg/d）為一般人群每日對某一食品的消費量；bw（kg）為人群平均體重[17]。

公式（2）中，HI（%）為危害指數(shù)；HQ（%）為危險商；ADI（mg/kg d）為每日允許攝入量[18]。

公式（3）中，NEDI（mg/kg bw）為國家估計每日攝入量；STMRi（mg/kg）為農(nóng)藥在某一食品中的規(guī)范殘留試驗中值；STMR－Pi（mg/kg）為用加工因子校正的規(guī)范殘留試驗中值。

公式（4）中，RQ（%）為農(nóng)藥的慢性膳食攝入風險商值[19]。

二、結果與討論

（一）方法的標準工作曲線在0.010～0.50 mg/L 線性范圍內(nèi)，葡萄和土壤樣品中嘧菌環(huán)胺、異菌脲的峰面積（y）與農(nóng)藥的進樣濃度（x）之間呈現(xiàn)良好的線性關系，其線性方程及定量限等見表2。

表2 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄和土壤中的線性方程、相關系數(shù)和定量限（LOQ）

表3 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄及土壤中的添加回收率和相對標準偏差 （n＝5）

（二）回收率和精確度嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄及土壤樣品中的添加回收率和相對標準偏差（n＝5）測定結果見表3。由結果可見，按照上文中前處理、GC－QqQ－MS/MS 檢測條件，在葡萄空白樣品中，添加水平濃度嘧菌環(huán)胺和異菌脲的平均回收率分別為92%～108%和84%～105%，相對標準偏差分別為1.1%～3.8%和3.5%～6.4%，土壤樣品中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的平均回收率分別為95%～106%和98%～100%，相對標準偏差分別為0.4%～2.9%和1.2%～5.7%，均符合NY/T 788－2004 《農(nóng)藥殘留試驗準則》 中殘留物的檢測方法要求，表明該檢測方法是可行的。葡萄樣品中嘧菌環(huán)胺和異菌脲標準樣品典型譜圖見圖2。

圖2 葡萄嘧菌環(huán)胺（a）和異菌脲（b）標準樣品色譜圖

圖3 葡萄中嘧菌環(huán)胺（a）與異菌脲（b）的消解趨勢

圖4 土壤中嘧菌環(huán)胺 （a）與異菌脲 （b）的消解趨勢

（三）消解動態(tài)2016－2017年葡萄和土壤中嘧菌環(huán)胺與異菌脲的消解趨勢如圖3～圖4 所示，具體試驗結果見表4。由結果可見，均符合一級動力學方程，隨著采樣間隔期的增加，農(nóng)藥總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。受實際生長環(huán)境中不可控因素的影響，其中有些采樣間隔期殘留量突然增大，但最終采樣間隔期35 d 時消解率在90%以上，在土壤中消解半衰期均＜30 d，說明嘧菌環(huán)胺和異菌脲屬于易降解的農(nóng)藥。在葡萄中的半衰期在不同年份同一地點的差異不大，但在土壤中的半衰期在不同年份同一地點差異顯著，這可能與當年施藥時間、氣溫、降水量、土壤中微生物的菌群和活躍程度有關。

表4 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄及土壤中的消解動態(tài)

（四）最終殘留以60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑施藥2 次，施藥間隔7 d，末次施藥后7、10、14 d 采集葡萄和土壤樣品，測定其嘧菌環(huán)胺和異菌脲最終殘留量，結果見表5～表6。由結果可見，葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留量分別為0.35～16 mg/kg 和0.051～4.8 mg/kg，土壤中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留量分別為＜0.010～3.2 mg/kg和＜0.010～0.49 mg/kg。結果表明，隨著采樣間隔的增加，嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄和土壤中的殘留量均逐漸降低。距最后一次施藥時間7 d 后，嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄的殘留量均低于我國制定的最大殘留限量值，且土壤中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留量值低于葡萄中的相應殘留值，對環(huán)境的風險影響相對較小。

表5 葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲最終殘留數(shù)據(jù)

表6 土壤中嘧菌環(huán)胺和異菌脲最終殘留數(shù)據(jù)

（五）風險評估一般人群對某種食品的消費量參見《2002年中國居民營養(yǎng)與健康現(xiàn)狀》，其中水果的日均消費量為0.0457 kg/d，人群的平均體重按照63 kg 計算，嘧菌環(huán)胺和異菌脲的ADI值分別為0.03 mg/kg bw 和0.06 mg/kg bw （GB 2763－2019），根據(jù)上文中風險評價的計算公式，分別對葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留中值、殘留最大值和最大殘留限量值進行風險評估，其HI、HQ和RQ值見表7。試驗數(shù)據(jù)顯示，采樣間隔7 d 之后葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的HQ、HI、RQ均小于100%，對人體健康風險較小且可控。

表7 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄中的風險評估

三、結論

根據(jù)推薦用量、施藥次數(shù)和采收間隔期，對60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑在葡萄和土壤中進行兩年兩地試驗，嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤的半衰期是6.6～11.2 d，異菌脲在葡萄和土壤的半衰期是1.7～18.7 d。江景勇等[12]和顏麗菊等[13]的研究結果顯示，嘧菌環(huán)胺在草莓中的消解半衰期為5.776 d，異菌脲在不同品種的楊梅果實中的半衰期有差異，在“東魁楊梅” 中的半衰期為9.20 d，在 “臨海早大梅” 中的半衰期為13.86 d，這與本試驗一致，同一作物不同品種的半衰期有一定差異。采收期間隔7 d 以后，嘧菌環(huán)胺在葡萄中的殘留量低于我國最大殘留限量值，但大于CAC、美國、澳大利亞、韓國、歐盟、日本制定的嘧菌環(huán)胺在葡萄中的最大限量值，因此在葡萄出口貿(mào)易中應注意嘧菌環(huán)胺殘留量超標問題。采收期間隔7 d 以后，異菌脲在葡萄中的殘留量低于上述國家制定的最大殘留限量值。嘧菌環(huán)胺和異菌脲復配劑的相互作用也可能會影響在葡萄和土壤中的消解半衰期和最終殘留量，還有待進一步探究。

我國已制定嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄中的最大殘留限量值 （MRL），結合兩年兩地的農(nóng)藥殘留量，分別對其各個采樣間隔期的殘留量中值、殘留量最大值和最大殘留限量值進行風險評估，從風險評估指標危險商和風險商上看，采樣間隔期7 d 以后，其均小于100%，表明嘧菌環(huán)胺和異菌脲對一般人類的健康不會產(chǎn)生危險。