基于近紅外光譜技術(shù)的壇紫菜產(chǎn)地溯源研究

劉 星 范 楷 錢群麗 姚春霞 饒欽雄 宋衛(wèi)國

（上海市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，上海 201403）

紫菜 （Pyropia/Porphyraspp.）是紅藻門的一種海藻，其富含蛋白質(zhì) （占干重的25%～50%）[1]、碳水化合物 （多糖、膳食纖維）、不飽和脂肪酸、礦物元素、維生素等營養(yǎng)組分和藻膽蛋白、硫酸多糖等生物活性成分[2]，具有抗氧化、抗增殖、抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、抗炎、抗粘附活性、抗高脂血癥、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等作用[3～8]，越來越受消費者的青睞，其產(chǎn)量也在逐年提升。根據(jù) 《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》，2018 年我國紫菜產(chǎn)量201 779 t，較 2017 年增加了 16.42%，是栽培海藻中增長最快的一種藻類，也是栽培海藻中經(jīng)濟產(chǎn)值最高的一種藻類。目前，紫菜的國內(nèi)產(chǎn)量占前兩位的省分別是福建?。?4 628 t）和浙江?。?4 016 t）[9]。

我國紫菜的主要養(yǎng)殖品種包括壇紫菜 （Porphyra haitanensis）和條斑紫菜 （Porphyra yezoensis）。壇紫菜主要分布于長江以南，主產(chǎn)于福建、浙江等省，壇紫菜產(chǎn)量約占國內(nèi)紫菜總產(chǎn)量的75%左右； 條斑紫菜主要分布于長江以北，集中在江蘇、山東等省[10]。隨著紫菜的消費量逐漸上升，其質(zhì)量安全問題也越來越吸引科研人員和消費者的關(guān)注。目前，科研人員已經(jīng)開展了紫菜的營養(yǎng)組分測定和比較[2]，風味物質(zhì)識別[11]，紫菜多糖和蛋白的提取條件優(yōu)化、理化性質(zhì)表征、生物活性評價、結(jié)構(gòu)鑒定等方面研究[3，6，8，10，12～13]。這些研究為消費者正確了解紫菜的營養(yǎng)價值和功能價值提供依據(jù)，可使消費者避免被 “塑料紫菜” 這樣的謠言所誤導[2，14～15]，研究結(jié)果也證實了不同產(chǎn)地紫菜營養(yǎng)組分和活性物質(zhì)種類、含量等是存在差異的，為保證紫菜產(chǎn)地的真實性提出技術(shù)需求。

目前已報道的紫菜產(chǎn)地真實性溯源方法有信息溯源 （二維碼、條形碼等）和多元素溯源方法[16]。但是，信息溯源依賴于信息記錄真實性，而多元素溯源中元素測定過程復雜，限制了這些技術(shù)在市場監(jiān)管中的實際應用。近紅外光譜技術(shù)（near infrared spectroscopy，NIRS）作為一種在食品產(chǎn)地溯源中廣泛應用的技術(shù)[17]，已在大米、茶葉、酒等農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源中得到應用[18～20]，它能綜合反映不同產(chǎn)地紫菜中各營養(yǎng)組分和活性成分的含量、結(jié)構(gòu)和功能團等特征的差異，且具有快速、無損、綠色的優(yōu)點，更適合用于市場上紫菜產(chǎn)地的溯源。因此，本研究針對占國內(nèi)紫菜市場份額75%的壇紫菜，以主產(chǎn)區(qū)福建和浙江兩省的壇紫菜為研究對象，應用NIRS 結(jié)合化學計量學方法開展壇紫菜的產(chǎn)地溯源判別，以期為保證不同產(chǎn)地壇紫菜的真實性提供技術(shù)支持和基礎數(shù)據(jù)支撐。

一、材料與方法

（一）材料與試劑2018 年在福建和浙江兩省共采集壇紫菜干樣品42 個。其中，福建省壇紫菜樣品17 個，來自福建寧德市、泉州市、福州市3個紫菜主產(chǎn)區(qū)； 浙江省壇紫菜樣品16 個，來自浙江臺州市、溫州市、寧波市3 個紫菜主產(chǎn)區(qū)； 未知產(chǎn)地壇紫菜干樣品9 個，用于溯源模型預測能力的比較。

（二）儀器與設備IS50 紅外光譜儀，配近紅外積分球附件，美國Thermofisher 公司； HK-02A中藥粉碎機，廣州旭朗機械設備有限公司。

（三）方法

1.樣品制備。將壇紫菜樣品用粉碎機粉碎后，通過0.425 mm 標準篩，放在干燥皿中72 h 以平衡樣品中的水分。

2.光譜采集。采用漫反射積分球模式采集近紅外光譜，光譜掃描波數(shù)范圍10 000～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32 次，光譜分辨率8 cm-1，以內(nèi)置背景為參照，數(shù)據(jù)變量共1 557 個，由儀器自帶的OMNIC 軟件以吸光度形式存儲。每個樣品平行實驗3次，取其平均光譜作為最終樣品光譜。整個實驗過程保持室內(nèi)溫度約25 ℃。

（四）溯源模型建立由于常用的平滑、求導、多元散射校正等預處理方法不能很好地改善模型的溯源能力，本研究在壇紫菜樣品光譜全波段范圍內(nèi)，應用無監(jiān)督算法系統(tǒng)聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）[21]、主成分分析（principal component analysis，PCA）[21～22]和有監(jiān)督算法貝葉斯判別分析（Bayes discrimination analysis，BDA）[21]、偏最小二乘判別分析 （partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）[23]方法開展壇紫菜的產(chǎn)地溯源判別。其中，HCA 和BDA 模型由R2009a Matlab 軟件 （美國 Thermofisher 公司）完成，PCA和PLS-DA 模型由 SIMCA 14.1 軟件 （瑞典Umetrics 公司）完成。

二、結(jié)果與分析

（一）壇紫菜的無監(jiān)督算法產(chǎn)地溯源已知產(chǎn)地的壇紫菜原光譜見圖1。由于福建、浙江兩省的部分海域相近，壇紫菜主要營養(yǎng)組分和活性成分的結(jié)構(gòu)和功能團相似，僅含量略有差別[2]，使得福建、浙江兩地壇紫菜的近紅外光譜峰形相似，且部分光譜重疊。因此，單獨通過近紅外光譜圖很難實現(xiàn)所有壇紫菜的產(chǎn)地溯源，需要應用化學計量學方法來實現(xiàn)。

圖1 壇紫菜的原光譜圖

HCA 是依據(jù)各樣品間距離的不同，將距離最近的樣品并為一類，并計算新類與其他類之間的距離，重復進行最近類別的合并，直到所有樣品歸為一類，形成聚類樹形圖，進而由樹形圖識別各類別樣品。這里單個樣品歸類通過歐氏距離并類，類與類之間通過類平均法 （即樣品對之間的平方距離的平均值）得到[21]。已知產(chǎn)地的壇紫菜樣品聚類結(jié)果見圖2，且由聚類的不一致系數(shù)確定最終類別為6。第①、②、③類中主要為福建樣品，僅有1 個浙江樣品； 第④類為浙江樣品，而第⑤和第⑥類中，雖然在更小類中部分兩地樣品能各自聚在一起，但兩地仍有很多樣品混合聚在一起?？梢姡ㄟ^類之間的距離差異還不能實現(xiàn)不同產(chǎn)地壇紫菜的完全溯源，這主要由于兩地壇紫菜各組分含量、結(jié)構(gòu)等相接近，譜圖之間的相關(guān)性明顯。因此，選用主成分分析 （PCA）把光譜中的多個變量 （總變量數(shù)為1 557）轉(zhuǎn)變?yōu)樯贁?shù)幾個綜合變量，即主成分，然后再進行壇紫菜的產(chǎn)地溯源，從而排除變量相關(guān)性的影響[21～22]。

壇紫菜的前兩個主成分得分圖見圖3。前兩個主成分對原變量解釋能力累積為0.994 7，說明前兩個主成分可以基本代表所有樣品的信息。浙江壇紫菜樣品中除了2 個 （圖3 中箭頭所指）樣品在縱坐標軸的右側(cè)外，其余樣品均落在縱坐標軸的左側(cè)，而福建壇紫菜有41.18%樣品落在縱坐標的左側(cè)，其余分散落在坐標軸的右側(cè)。因此，通過PCA 進行壇紫菜產(chǎn)地溯源的正確率約為72.73%，這一正確率仍需進一步改善。由于上述兩種無監(jiān)督算法無法對組間差異不明顯的樣本進行準確判別，如圖2 中第⑤和第⑥類，圖3 中與浙江樣品混合的福建壇紫菜樣品，因此，再運用有監(jiān)督算法BDA和PLS-DA 來進一步提高壇紫菜產(chǎn)地溯源正確率。

圖2 壇紫菜聚類樹形圖

圖3 壇紫菜的主成分得分圖

（二）壇紫菜的有監(jiān)督算法產(chǎn)地溯源貝葉斯判別分析（BDA）是將研究對象先通過一個先驗概率來描述已有認知，再通過樣本修正先驗概率，得到后驗概率，最后基于后驗概率進行樣本的判別[21]。BDA 對已知產(chǎn)地壇紫菜樣品的溯源結(jié)果見表1。福建壇紫菜中有7 個樣品被錯判為浙江壇紫菜，溯源正確率為58.82%，浙江壇紫菜中有1 個樣品被錯判為福建壇紫菜，溯源正確率為93.75%，總判別正確率為75.26%，這一結(jié)果與PCA 類似。結(jié)果表明，BDA 可以很好地實現(xiàn)浙江壇紫菜的溯源，但是對福建壇紫菜的溯源準確率仍需繼續(xù)改善。

表1 BDA 模型溯源結(jié)果

PLS-DA 是一種基于偏最小二乘的有監(jiān)督算法，可以借助變量的權(quán)重來找出不同類別的差異，進而對不同類別樣品進行有效區(qū)分[22～23]。壇紫菜的PLS-DA 模型主成分數(shù)、主成分數(shù)對原變量的解釋能力（R2X）和產(chǎn)地溯源正確率見表2，其前兩個主成分得分圖見圖4。前兩個主成分對原變量的解釋能力累積為0.994，所得壇紫菜溯源正確率為72.73%，其中有6 個福建壇紫菜樣品被錯判為浙江壇紫菜，3 個浙江樣品被錯判為福建壇紫菜。隨著主成分數(shù)增多，R2X 值在逐漸增加，PLS-DA 模型的溯源正確率也在逐漸提高，當主成分數(shù)增加到12 時，溯源正確率達100%，說明最優(yōu)PLS-DA 模型可以實現(xiàn)已知產(chǎn)地的福建和浙江壇紫菜產(chǎn)地溯源。

表2 PLS-DA 模型的溯源結(jié)果

圖4 PLS-DA 前兩個主成分得分圖

圖 5 HCA （a）、PCA （b）和 PLS-DA （c）對未知產(chǎn)地樣品的預測

（三）未知產(chǎn)地壇紫菜的溯源將HCA、PCA、BDA 和PLS-DA 模型分別用于9 個未知產(chǎn)地的壇紫菜溯源，結(jié)果見圖 5 和表 1。如圖 5a 所示，HCA 模型將3 個未知產(chǎn)地壇紫菜與福建壇紫菜聚在一起，其余6 個樣品與浙江壇紫菜聚類，說明可能有3 個未知產(chǎn)地樣品是福建壇紫菜，有6 個未知產(chǎn)地樣品為浙江壇紫菜。如圖5b 所示，PCA 模型將1 個未知產(chǎn)地壇紫菜落到了縱坐標軸的右側(cè)，其余8 個未知產(chǎn)地樣品在縱坐標軸的左側(cè)，說明縱坐標軸右側(cè)的1 個樣品更可能是福建壇紫菜，而縱坐標軸左側(cè)的8 個樣品更可能是浙江壇紫菜； 如表1所示，BDA 模型將1 個未知產(chǎn)地壇紫菜預測為福建壇紫菜，其余8 個未知產(chǎn)地樣品被判為浙江壇紫菜，但是由于原 BDA 模型的溯源正確率僅為75.26%，所以對9 個未知產(chǎn)地壇紫菜預測的準確性有待進一步證實。如圖5c 所示，PLS-DA 模型將9 個未知產(chǎn)地壇紫菜中的1 個判為福建壇紫菜，其余8 個樣品判為浙江壇紫菜，但由于原最優(yōu)PLS-DA 模型對福建和浙江壇紫菜的溯源正確率為100%，結(jié)合圖 5b、5c 及表 1 的預測結(jié)果，可以確認9 個未知產(chǎn)地壇紫菜中有1 個為福建壇紫菜，其余8 個為浙江壇紫菜。這些結(jié)果證實了PLS-DA溯源模型在判別福建和浙江兩省壇紫菜產(chǎn)地時具有很好的預測能力和穩(wěn)健性。

三、結(jié)論

本研究基于不同產(chǎn)地壇紫菜中營養(yǎng)組分和活性成分含量的差異而使得其近紅外光譜圖有不同的峰特征，再將光譜數(shù)據(jù)與化學計量學方法結(jié)合，進行福建和浙江兩省壇紫菜的產(chǎn)地溯源。由于福建和浙江兩省部分養(yǎng)殖海域相近，所產(chǎn)壇紫菜的各組分綜合特征在近紅外光譜中的表現(xiàn)相似，使得譜圖出現(xiàn)重疊、共線性等現(xiàn)象。因此，依據(jù)樣品間距離進行分類的HCA 法很難將兩省壇紫菜進行正確溯源；PCA 法可以解決樣品信息重疊、相關(guān)的問題，但是由于PCA 屬于無監(jiān)督算法，對于組間差異不明顯的樣品很難進行準確的產(chǎn)地溯源，其溯源的正確率約為72.73%； BDA 作為一種有監(jiān)督的算法，對于兩省壇紫菜的溯源正確率為75.26%，略高于PCA，而 PLS-DA 當取前 12 個主成分時，對福建和浙江兩省壇紫菜的溯源正確率可達100%。通過9 個未知產(chǎn)地壇紫菜來驗證模型的預測能力和穩(wěn)健性，結(jié)果顯示，PCA、BDA 和 PLS-DA 模型的預測結(jié)果一致，9 個未知壇紫菜中只有1 個樣品可能是福建壇紫菜，其余8 個樣品可能為浙江壇紫菜，說明PCA、BDA 和PLS-DA 模型均具有良好的預測能力，也證明PLS-DA 模型具有更好的穩(wěn)健性，可以用于福建和浙江兩省壇紫菜的產(chǎn)地溯源，進而可以為保證壇紫菜產(chǎn)地的真實性提供技術(shù)參考。