基于氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的補(bǔ)血益母丸治療氣血兩虛小鼠的代謝組學(xué)研究

李亞梅　賓雨飛　夏伯候　羅弘杉　徐佳　張鵬　龔云　廖端芳　林麗美

〔摘要〕 目的 研究補(bǔ)血益母丸干預(yù)氣血兩虛模型小鼠內(nèi)源性代謝物的變化，尋找與治療氣血兩虛相關(guān)的代謝生物標(biāo)志物，探討補(bǔ)血益母丸對(duì)氣血兩虛模型的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。方法 采用眼眶放血和腹腔注射環(huán)磷酰胺建立氣血兩虛小鼠模型，造模成功后將動(dòng)物分為模型組、乳酸亞鐵組、四物湯組、補(bǔ)血益母丸低劑量組和補(bǔ)血益母丸高劑量組，借助氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)，對(duì)小鼠血清樣本代謝物進(jìn)行檢測(cè)，采用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）篩選差異代謝物。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中促紅細(xì)胞生成素（EPO）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素2（IL-2）的含量。結(jié)果 對(duì)照組、模型組和補(bǔ)血益母丸治療組血清樣本能夠得到很好的區(qū)分，共鑒定出14種潛在生物標(biāo)志物，補(bǔ)血益母丸給藥后氣血兩虛小鼠的內(nèi)源性代謝物水平發(fā)生不同程度的回調(diào)。與正常組相比，模型組小鼠血清中TNF-α明顯升高（P<0.01），IL-2、EPO和GM-CFS明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，補(bǔ)血益母丸低、高劑量組小鼠血清中TNF-α含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）; IL-2、GM-CFS及EPO含量明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 補(bǔ)血益母丸可以使氣血兩虛小鼠的異常代謝有所恢復(fù)，其治療作用可能與機(jī)體內(nèi)14個(gè)差異代謝物及3條相關(guān)代謝通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)血益母丸;氣血兩虛;氣質(zhì)聯(lián)用;代謝組學(xué)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.010

〔Abstract〕 Objective To study the changes of endogenous metabolites of Buxue Yimu Pill in mice with qi-blood deficiency， find related metabolic biomarkers， and explore the effects and mechanism of Buxue Yimu Pill on qi-blood deficiency model. Methods The qi-blood deficiency mouse model was established by orbital exsanguination and intraperitoneal injection of cyclophosphamide. After successful modeling， the animals were divided into model group， ferrous lactate group， Siwu Decoction group， low-dose group and high-dose group of Buxue Yimu Pill. The serum metabolites of mice were measured by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. Principal component analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DAa） were used to screen the different metabolites. The content of erythropoietin （EPO）， granulocyte macrophage colony stimulating factor （GM-CSF）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-2 （IL-2） in mouse serum was detected by ELISA. Rseults The serum samples of the control group， model group and high-dose of Buxue Yimu Pill group could be well distinguished. A total of 14 potential biomarkers were identified. The levels of endogenous metabolites restored in varying degrees after the treatment of Buxue Yimu Pill. Compared with the control group， the serum levels of TNF-α in the model group significantly increased （P<0.01）， while the levels of IL-2， EPO and GM-CFS in the model group significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， the serum levels of TNF-α in the mice with low and high dose of Buxue Yimu Pill were significantly reduced （P<0.05， P<0.01）， while the levels of IL-2， GM-CFS and EPO were significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Buxue Yimu Pill can restore the abnormal metabolism of qi-blood deficiency mice， and its therapeutic effect may be related to the regulation of 14 metabolites and 3 related metabolic pathways in the organism.

〔Keywords〕 Buxue Yimu Pill; qi-blood deficiency; gas chromatography-mass spectrometry; metabolomics

氣血兩虛證是一種整體的、綜合的病證，多因失血過(guò)多或久病過(guò)勞或年老體衰等導(dǎo)致氣、血功能或臟腑組織的機(jī)能活動(dòng)減退[1]。血虛證多見于機(jī)體骨髓造血功能減退、造血微環(huán)境變化、胸腺及脾臟細(xì)胞過(guò)度凋亡等;氣虛證多見機(jī)體免疫功能下降，引起免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子等不同水平的功能損傷。氣血互生互用，氣推動(dòng)血運(yùn)行，血方可滋養(yǎng)全身。若機(jī)體血虛不足，則氣缺乏血的供養(yǎng)而出現(xiàn)氣虛癥狀;若未及時(shí)干預(yù)，將發(fā)展為氣血兩虛證[2]。

補(bǔ)血益母丸為株洲千金藥業(yè)獨(dú)家研制產(chǎn)品，由當(dāng)歸、黃芪、阿膠、益母草和陳皮5味中草藥組成，具有祛瘀生新、補(bǔ)益氣血的雙重功效。方中當(dāng)歸性溫，味甘辛，歸肝、心、脾經(jīng)，擅補(bǔ)血活血，為君藥;黃芪性溫，味甘，歸脾、胃、腎經(jīng)，擅補(bǔ)中氣、益元?dú)舛ㄕ{(diào)血脈;阿膠味甘，性平，歸肺、腎、肝經(jīng)，擅滋陰補(bǔ)血止血，為補(bǔ)血要藥，二者配合能增進(jìn)益氣補(bǔ)血之功，為臣藥;陳皮性溫，味辛苦，具有溫胃散寒、理氣健脾的功效;益母草性微寒，味辛苦，歸心、肝、膀胱經(jīng)，活血調(diào)經(jīng)，與陳皮共為佐藥[3]。

代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科，與蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比，具有其特殊優(yōu)勢(shì)。首先，代謝組學(xué)放大了基因和蛋白的微小變化，從而使檢測(cè)更加容易;其次，代謝組學(xué)不需要建立全基因測(cè)序庫(kù)且代謝產(chǎn)物的種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于基因和蛋白，從而減少了工作量;最重要的一點(diǎn)，代謝組學(xué)是最接近表型的研究方法，通過(guò)代謝產(chǎn)物分析可以系統(tǒng)地反映機(jī)體的病理生理狀態(tài)[4-5]。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，運(yùn)用代謝組學(xué)方法可以系統(tǒng)地研究中藥作用于機(jī)體后內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，為研究該藥的作用機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)的佐證基礎(chǔ)[6]?；贕C-MS為分析手段的代謝組學(xué)，對(duì)生物體體液、組織提取物等進(jìn)行系統(tǒng)分析，找出相關(guān)的差異代謝物，闡述相關(guān)的代謝路徑，對(duì)機(jī)體整體的狀況和功能做出評(píng)價(jià)，從而探討其應(yīng)用于疾病診斷的可行性[7-8]。目前，代謝組學(xué)技術(shù)多用于中藥復(fù)方，既能夠從整體觀角度考察中藥復(fù)方的療效，又能從生物標(biāo)志物及代謝通路層面考察中藥復(fù)方的作用機(jī)制[9]。

本研究采用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)對(duì)各組小鼠血清樣本進(jìn)行測(cè)定，采用主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）來(lái)篩選差異性代謝物。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中EPO、GM-CSF、TNF-α和IL-2的含量，尋找與治療氣血兩虛有關(guān)的代謝生物標(biāo)志物，探討補(bǔ)血益母丸對(duì)氣血兩虛模型小鼠的調(diào)節(jié)作用及其可能機(jī)制。

1 材料

1.1? 動(dòng)物

昆明小鼠[動(dòng)物許可證編號(hào)：SCKK（湘）2016-0002]，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。所有小鼠均自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，稱取體質(zhì)量。

1.2? 藥物

補(bǔ)血益母丸（批號(hào)20181205，規(guī)格：12 g×10袋，湖南株洲千金藥業(yè)股份有限公司）;環(huán)磷酰胺（批號(hào)18091225，規(guī)格：0.2 g/瓶，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）;四物湯（白芍10 g，川芎10 g，當(dāng)歸10 g，生地黃10 g），購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院三九顆粒藥房;乳酸亞鐵口服液（批號(hào)20180815，規(guī)格：10 mL×10支，石家莊宇惠制藥有限公司）。

環(huán)磷酰胺配制成濃度為10 mg/mL的溶液，四物湯沖劑配制成濃度為0.8 g/mL的溶液，補(bǔ)血益母丸配制成91 mg/mL和364 mg/mL的混懸液。

1.3? 主要試劑及儀器

甲醇、無(wú)水乙醇（100092683）、二甲苯（10023418）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲氧胺（BCBP2843V）、吡啶（STBF7305V）、蘋果酸（04027AEV）、N，O-雙（三甲基硅烷基）、乙酰胺（BSTFA，BCBR2690V）均購(gòu)自Sigma公司;EPO ELISA試劑盒（E-EL-M0027c）、GM-CSF ELISA試劑盒（E-EL-M0032c）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;IL-2高敏ELISA試劑盒（70-EK202HS-96）、TNF-α高敏ELISA試劑盒（70-EK282HS-96）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;GC-MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）;DC-24型24位氮吹儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）;5415R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）;多功能酶標(biāo)儀（5 L×800，Bio Tek）、水平搖床（TS-1）（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）;Vortex QL-901渦旋振蕩器（德國(guó)維根實(shí)驗(yàn)通用設(shè)備公司）;BSA6202S-CW電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

2 方法

2.1? 氣血兩虛小鼠模型的建立和干預(yù)方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參考方曉艷等[10]和袁拯忠等[11]方法建立氣血兩虛小鼠模型，除正常對(duì)照組小鼠外，其余小鼠均用于模型建立，分別在第1、3、5、7、9天，每只小鼠予眼眶采血0.3～0.5 mL;第2、4、6、8天，每只小鼠（注射前需禁食不禁水12 h）經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺80、40、40、40 mg/kg，正常對(duì)照組腹腔注射相同體積的生理鹽水。于第9天末次眼眶采血后送至湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診檢驗(yàn)科完成血常規(guī)檢測(cè)分析。

將50只已造模好的小鼠隨機(jī)分為模型組、乳酸亞鐵組（西藥陽(yáng)性藥物）、四物湯組（中藥陽(yáng)性藥物）、補(bǔ)血益母丸低劑量組和補(bǔ)血益母丸高劑量組，每組10只。補(bǔ)血益母丸人用量為24 g/d，乳酸亞鐵口服液人用量為30～60 mL/d，四物湯人用劑量為40 g/d，根據(jù)人-小鼠體表面積劑量換算得到小鼠給藥劑量。正常對(duì)照組與模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃;乳酸亞鐵組10 mL/kg（等效劑量的2倍）灌胃;四物湯組12 g/kg（等效劑量的2倍）的劑量灌胃;補(bǔ)血益母丸低、高劑量組分別給予1.82 g/kg（等效劑量的1/2）和7.28 g/kg（等效劑量的2倍）的劑量灌胃。連續(xù)灌胃10 d。

給藥結(jié)束后，摘除小鼠眼球取血，全血存于1.5 mL

EP管中，靜置3 h后于4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取上清分清至新的EP管中，-80 ℃保存，備用。

2.2? GC-MS法分析血清樣本代謝物

2.2.1? 樣品前處理? 取不同組別小鼠血清100 μL混合均勻，作為質(zhì)控樣本（QC）。將凍存于-80 ℃的血清于4 ℃冰箱解凍3 h;向血清中加入50 μL蘋果酸（內(nèi)標(biāo)，1 mg/mL），渦旋混勻30 s，加入450 μL甲醇除去蛋白，渦旋混合，靜置8 min后13 000 r/min離心10 min，取上清液，氮?dú)獯蹈伞?/p>

向殘?jiān)屑尤?0 μL甲氧胺-吡啶（20 mg/mL），置于70 ℃預(yù)先加熱好的水浴鍋內(nèi)反應(yīng)1 h;再加入100 μL BSTFA，混勻，繼續(xù)70 ℃下反應(yīng)1 h，室溫下放置2 h，樣品于13 000 r/min離心8 min，取上清100 μL至250 μL內(nèi)插管，放入進(jìn)樣瓶用于GC-MS檢測(cè)[12]。

2.2.2? GC-MS數(shù)據(jù)采集? 參照周亞敏等實(shí)驗(yàn)條件[13]，具體設(shè)置為：氣相-質(zhì)譜色譜聯(lián)用儀上采集數(shù)據(jù)，色譜柱為DB-5MS石英毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 mm，0.25 μm）;進(jìn)樣量1 μL;載氣為氦氣（99.999%），流速為1.0 mL/min;分流比10∶1;柱溫在70 ℃保持4 min后，以20 ℃/min的速度升溫至110 ℃，再以8 ℃/min的速度升溫至270 ℃，并保持5 min。進(jìn)樣口溫度為280 ℃，電子轟擊離子源溫度為200 ℃;溶劑延遲時(shí)間為6.5 min;質(zhì)譜掃描范圍m/z 35～550。

2.2.3? 數(shù)據(jù)分析? 將GC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為化合物的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積信息，進(jìn)行PCA、OPLS-DA，以上分析采用SMICA 14.0軟件處理;采用SPSS 21.0軟件處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析和單因素方差分析（one-way ANOVA）顯著性水平設(shè)為P<0.05;生物標(biāo)志物處理用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3? ELISA法檢測(cè)血清造血因子和免疫因子的含量

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書，分別檢測(cè)血清中IL-2、TNF-α、EPO以及GM-CSF的含量。將存于-80 ℃的血清逐級(jí)解凍，倍比稀釋法配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入相應(yīng)的孔中，按順序?qū)颖荆靠?00 μL）加入到樣本孔中，37 ℃恒溫孵育90 min;棄去液體，甩干;每孔加入100 μL的生物素化抗體稀釋液，37 ℃孵育1 h;甩干液體，洗板3次;每孔加入100 μL的酶結(jié)合物稀釋液，37 ℃孵育30 min;甩干液體，洗板5次;每孔加入90 μL的底物溶液，37 ℃孵育15 min;每孔加入50 μL的反應(yīng)終止液，終止反應(yīng);于酶標(biāo)儀上測(cè)其450 nm下每孔的吸光度值，記錄結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1? GC-MS分析血清代謝物

3.1.1? GC-MS圖譜與代謝物質(zhì)指認(rèn)? 對(duì)正常組、模型組、補(bǔ)血益母丸給藥組和陽(yáng)性藥物組的小鼠血清樣本進(jìn)行GC-MS分析，得到總離子流色譜圖（圖1）。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)對(duì)總離子流色譜圖進(jìn)行噪聲處理、基線校正等處理后，共得到100個(gè)變量峰，對(duì)其中相似度大于80%的39個(gè)化合物進(jìn)行了鑒別。見表1。

3.1.2? 多元變量數(shù)據(jù)分析? 在PCA模型中，發(fā)現(xiàn)正常組和模型組兩組具有一定分離度，進(jìn)一步對(duì)兩者進(jìn)行分類處理，類別間的數(shù)學(xué)模型（OPLS-DA），建立的模型解釋能力參數(shù)R2Y、預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2分別為0.75、0.59，說(shuō)明該模型的區(qū)分程度和預(yù)測(cè)程度都較好。在OPLS-DA模型中，得分圖顯示兩組樣本間分類明顯（圖2A），為防止模型過(guò)擬合，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行模型驗(yàn)證（200次），模型預(yù)測(cè)參數(shù)R2小于0.4，Q2小于-0.05，表明模型可靠（圖2B），這對(duì)后期代謝物分析準(zhǔn)確性提供依據(jù)。為了更好地對(duì)正常組、模型組、補(bǔ)血益母丸給藥組和陽(yáng)性藥物組的小鼠血清代謝譜進(jìn)行分型，我們采用PLS-DA和OPLS-DA方法對(duì)得到的38個(gè)變量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從圖2C、2D可知，補(bǔ)血益母丸給藥組和陽(yáng)性藥物組均在模型組和正常組之間，由此說(shuō)明，經(jīng)藥物治療后，3組小鼠血清代謝物水平趨向于正常發(fā)展，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，相比于陽(yáng)性藥物組，補(bǔ)血益母丸給藥組在代謝物水平恢復(fù)能力上較強(qiáng)于陽(yáng)性西藥組和陽(yáng)性中藥組，陽(yáng)性西藥組向正常組恢復(fù)效果較好。

3.1.3? 潛在代謝標(biāo)志物確定? 在分析正常組和模型組時(shí)，兩者分別在y軸的作用兩側(cè)，說(shuō)明兩者具有明顯的代謝差異（圖2B）。因此，為探究?jī)烧卟町愇?，需要在PLS-DA模型進(jìn)行關(guān)鍵變量分析，即通過(guò)VIP值來(lái)篩選差異代謝物，VIP>1的變量被認(rèn)為對(duì)分類起著關(guān)鍵作用，見圖3。對(duì)篩選的差異代謝物進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，同時(shí)符合VIP>1且P<0.05的6個(gè)變量被認(rèn)為與血虛有潛在關(guān)聯(lián)，并利用KEGG、HMDB等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)變量結(jié)構(gòu)鑒定并用標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證（表2），從表2可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中的纈氨酸、尿素、甘氨酸、2-丁烯二酸、脯氨酸、十六酸、亞油酸、十八酸、花生四烯酸水平均顯著下調(diào)，而3-羥基丁酸、異亮氨酸、蘇氨酸、果糖、葡萄糖含量顯著上調(diào)。這14種物質(zhì)被確定為氣血兩虛小鼠血清潛在代謝標(biāo)志物。

3.1.4? 潛在生物標(biāo)記物層次聚類分析? 層次聚類分析獲得潛在生物標(biāo)志物的熱力圖，如圖4所示。從該熱圖能夠直觀顯示出14種潛在生物標(biāo)志物在各組之間的含量變化。從圖中可以看出，正常組和模型組中潛在生物標(biāo)志物含量水平能夠明顯區(qū)分，補(bǔ)血益母丸高劑量組和模型組中潛在生物標(biāo)志物含量水平也有較好區(qū)分。

3.1.5? 代謝通路分析? 將所篩選得到的潛在生物標(biāo)志物輸入MetaboAnalyst網(wǎng)站中進(jìn)行通路分析，以Impact值大于0.1選為潛在相關(guān)代謝通路，結(jié)果顯示這些生物標(biāo)志物共涉及到3條主要通路，分別是Linoleic acid metabolism（亞油酸代謝），Glycine， serine and threoine metabolism（甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝），Arginine and Proline metabolism（精氨酸與脯氨酸代謝），結(jié)果如圖5所示，由此可知，經(jīng)環(huán)磷酰胺造模后，小鼠機(jī)體發(fā)生紊亂，主要集中于脂肪酸代謝和氨基酸代謝。

3.2? 血清中炎癥因子和免疫因子含量

與正常組相比，模型組小鼠血清中TNF-α明顯升高（P<0.01）;與模型組相比，補(bǔ)血益母丸低、高劑量組小鼠血清中TNF-α含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。與正常組相比，模型組小鼠血清中IL-2、EPO和GM-CFS明顯降低（P<0.01）;與模型組相比，補(bǔ)血益母丸低、高劑量組小鼠血清中IL-2、EPO和GM-CFS均有一定的上升（P<0.05，P<0.01）。見圖6。

4 討論

氣血兩虛證涉及機(jī)體多種變化，研究[14-15]表明主要集中于體內(nèi)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，傳統(tǒng)藥理學(xué)研究通常只對(duì)單一或少數(shù)幾個(gè)因素進(jìn)行研究，缺乏整體性和綜合性。代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)研究中不可或缺的[16]，采用一種全景式研究理念，客觀認(rèn)識(shí)機(jī)體生理和病理變化實(shí)質(zhì)，系統(tǒng)化地描述機(jī)體全局性代謝網(wǎng)絡(luò)[17]。本研究采用GC-MS聯(lián)合模式識(shí)別和統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)氣血兩虛小鼠的血液內(nèi)源性代謝物進(jìn)行初步探索。

經(jīng)分析得到了較好的分類模式，分析正常組與模型組、模型組與補(bǔ)血益母丸給藥組之間的內(nèi)在差異物，得到14個(gè)差異標(biāo)志物，包括5種氨基酸（甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、異亮氨酸）、5種脂肪酸及其代謝產(chǎn)物（亞油酸、硬脂酸、花生四烯酸、棕櫚反油酸、3-羥基丁酸），2種糖類（果糖、葡萄糖），1種三羧酸循環(huán)中的重要中間產(chǎn)物（2-丁烯二酸）和尿素。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有著重要作用[18]。甘氨酸和脯氨酸為非必需氨基酸，可調(diào)節(jié)血清中鐵離子含量，促進(jìn)血清中蛋白質(zhì)合成[19]。血虛模型小鼠的肝臟會(huì)嚴(yán)重受損，體內(nèi)紅細(xì)胞發(fā)生溶血，血紅蛋白含量下降，促使其合成加快，甘氨酸和脯氨酸代謝加強(qiáng)，消耗增加，含量顯著降低。此外，甘氨酸抗肝損傷會(huì)大量消耗，含量進(jìn)一步降低。纈氨酸是一種支鏈必需氨基酸和生糖氨基酸[20]，可調(diào)節(jié)血糖含量、修復(fù)組織，為機(jī)體供能。血虛狀態(tài)時(shí)，纈氨酸可給肌肉提供額外能量，防止肌肉衰弱，故模型組血清中纈氨酸含量顯著下降。蘇氨酸和異亮氨酸為必需氨基酸，前者主要維持機(jī)體蛋白平衡，后者是生糖兼生酮氨基酸，促進(jìn)血紅蛋白形成，氣血兩虛小鼠血紅蛋白合成量降低，蘇氨酸和異亮氨酸參加相關(guān)代謝降低，因此，其在血中含量增加[21]。尿素是蛋白質(zhì)的最終代謝產(chǎn)物，血虛時(shí)，小鼠體內(nèi)氨基酸代謝受到抑制，使血清尿素含量顯著下降。給予補(bǔ)血益母丸治療后，小鼠血清中代謝物向正常組靠攏，說(shuō)明補(bǔ)血益母丸治療氣血兩虛可能與調(diào)節(jié)氨基酸代謝相關(guān)，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力調(diào)節(jié)氣血。

差異代謝物中有5種脂肪酸及其代謝產(chǎn)物。血虛時(shí)，血糖下降，為補(bǔ)充機(jī)體所需能量，機(jī)體動(dòng)用脂肪在肝臟產(chǎn)生酮體3-羥基丁酸，進(jìn)入血液給機(jī)體供能;此時(shí)，脂類代謝代償性增強(qiáng)，亞油酸參與脂肪分解和新陳代謝，因此，血虛小鼠血中亞油酸含量降低[22]?；ㄉ南┧峥山档脱吼ざ取⒄{(diào)節(jié)血細(xì)胞功能[23]，在血虛狀態(tài)下，小鼠體內(nèi)花生四烯酸含量降低，外周血常規(guī)紊亂，血細(xì)胞功能降低。經(jīng)補(bǔ)血益母丸治療后，血虛小鼠血清中脂肪酸也向正常組小鼠靠攏，說(shuō)明補(bǔ)血益母丸可通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸類物質(zhì)發(fā)揮抗氣血兩虛作用。

造模后，機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞發(fā)生溶血，血液中氧含量顯著下降，糖酵解與糖異生代謝加強(qiáng)，使得糖類物質(zhì)含量上升，經(jīng)補(bǔ)血益母丸干預(yù)后，相關(guān)能量代謝加強(qiáng)，機(jī)體血液中氧含量恢復(fù)正常，進(jìn)而緩解血虛狀態(tài)。

TNF-α是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，參與造血和免疫調(diào)節(jié)[24]。IL-2是具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮雙向免疫調(diào)節(jié)作用[25]。而EPO和GM-CSF均為集落刺激因子，能興奮骨髓造血功能[1]。本研究表明補(bǔ)血益母丸可有效下調(diào)氣血兩虛小鼠血清中TNF-α含量，上調(diào)血清中IL-2的量，發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。補(bǔ)血益母丸能促進(jìn)血清EPO和GM-CSF的生成，改善骨髓造血情況而達(dá)到治療氣血虛的效果。

以GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合代謝通路調(diào)控分析在小鼠血清中潛在的生物標(biāo)志物，這些代謝物的變化參與了機(jī)體的脂肪酸代謝、氨基酸代謝、能量代謝等，經(jīng)補(bǔ)血益母丸治療后，其中部分代謝物水平向正常組靠攏。因此，推測(cè)補(bǔ)血益母丸主要通過(guò)改善肝功能、抗氧化損傷、增強(qiáng)血細(xì)胞功能、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫和抑制細(xì)胞凋亡等途徑改善血虛。

綜上所述，補(bǔ)血益母丸可通過(guò)改善氣血兩虛小鼠脂肪酸、氨基酸和能量代謝，同時(shí)，提高小鼠免疫功能來(lái)發(fā)揮治療氣血兩虛證的作用。

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