地黃飲子對運動性疲勞小鼠運動能力的影響

井宏穎　呂克寧　宋曉晨　周妍妍

〔摘要〕 目的 探討地黃飲子對運動性疲勞小鼠運動能力的影響。方法 將昆明小鼠30只隨機分為安靜對照組（安靜組）、疲勞模型組（模型組）和地黃飲子組，每組10只。采用游泳訓(xùn)練方式建立小鼠疲勞模型。常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，地黃飲子組給予地黃飲子水煎液灌胃，安靜組和模型組給予蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥28 d。ELISA法檢測血尿素氮、睪酮、皮質(zhì)醇含量和肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性、丙二醛（MDA）含量;Western blot法檢測腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和過氧化物酶增殖活化受體輔激活因子1α（PGC-1α）蛋白表達(dá)量。結(jié)果 與安靜組比較，模型組小鼠體質(zhì)量明顯升高（P<0.05）;血睪酮含量明顯降低（P<0.05）;皮質(zhì)醇、尿素氮含量顯著升高（P<0.05）;肝組織GSH-Px、SOD活性顯著降低（P<0.05），MDA含量明顯升高（P<0.05）;AMPK和PGC-1α的蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。與模型組比較，地黃飲子組小鼠體質(zhì)量增加明顯（P<0.05）;力竭游泳時間明顯延長（P<0.05）;血睪酮含量明顯升高（P<0.05）;皮質(zhì)醇、尿素氮含量顯著降低（P<0.05）;肝組織GSH-Px、SOD活性顯著增強（P<0.05），MDA含量明顯降低（P<0.05）;AMPK和PGC-1α的蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。結(jié)論 地黃飲子能夠在一定程度上起到緩解運動性疲勞的作用，其可能機制是通過降低運動性疲勞模型小鼠血皮質(zhì)醇、尿素氮、MDA含量，提高肝組織GSH-Px、SOD活性及AMPK/PGC-1α信號通路對能量代謝的調(diào)節(jié)能力，從而提升小鼠運動能力。

〔關(guān)鍵詞〕 運動性疲勞;地黃飲子;運動能力;腺苷酸活化蛋白激酶;過氧化物酶增殖活化受體輔激活因子1α

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.007

〔Abstract〕 Objective? To study the effect of Radix Rehmanniae Decoction on exercise ability of mice with exercise fatigue. Methods 30 Kunming mice were randomly divided into quiet control group （quiet group）， fatigue model group （model group） and Radix Rehmanniae Decoction group， and 10 mice in each group. The fatigue model of mice was established by swimming training. In addition to conventional feed feeding， the Radix Rehmanniae Decoction group was given a gavage of Radix Rehmanniae Decoction， and the quiet group and the model group were given gavage of distilled water for 28 consecutive days. The levels of blood urea nitrogen （BUN）， testosterone and cortisol， the activities of superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSH-PX） and malondialdehyde （MDA） in liver tissue were detected by ELISA; the protein expression of adenylate activated protein kinase （AMPK） and peroxisome proliferating activated receptor coactivator-1α （PGC-1α） were detected by Western blot. Results Compared with the quiet group， the body mass of the model group was significantly increased （P<0.05）; the content of serum testosterone decreased significantly （P<0.05）; the contents of cortisol and BUN were significantly increased （P<0.05）; the activity of GSH-PX and SOD in liver tissues was significantly decreased （P<0.05）， and the content of MDA was significantly increased （P<0.05）; the expression of AMPK and PGC-1α was increased （P<0.05）. Compared with the model group， the body mass of mice in the Radix Rehmanniae Decoction group increased significantly （P<0.05）; the exhausted swimming time was significantly prolonged （P<0.05）; the blood testosterone content was significantly increased （P<0.05）; the contents of cortisol and BUN was significantly reduced （P<0.05）; GSH-Px and SOD activities in liver tissue were significantly increased （P<0.05）， and MDA content was significantly reduced （P<0.05）; the expression of AMPK and PGC-1α was increased（P<0.05）. Conclusion Radix Rehmanniae Decoction can play a role in alleviating sports fatigue to a certain extent， the mechanism may be by reducing the content of cortisol， BUN and MDA in sports fatigue model mice， increasing the activity of GSH-Px and SOD， and enhancing the regulation of AMPK / PGC-1α signaling pathway on energy metabolism， which can enhance exercise capacity of mice.

〔Keywords〕 exercise fatigue; Radix Rehmanniae Decoction; exercise ability; adenylate activated protein kinase; peroxisome proliferator activated receptor coactivator 1α

運動性疲勞的研究從19世紀(jì)初開始，至今一直是運動醫(yī)學(xué)研究的熱點。運動性疲勞是指運動后導(dǎo)致機體生理過程不能持續(xù)其功能在特定水平上和（或）各器官不能維持預(yù)定的運動強度的現(xiàn)象[1]。運動性疲勞產(chǎn)生后會降低機體的運動能力，也會使機體產(chǎn)生相應(yīng)的生理生化以及病理的改變。減弱或緩解運動性疲勞產(chǎn)生的運動能力下降問題，一直是體育和醫(yī)學(xué)相關(guān)學(xué)科共同研究的課題。中醫(yī)藥在抗疲勞方面和提高運動能力方面的研究中獲得了大量的經(jīng)驗，且有良好的效果。

通過臨床病例觀察中發(fā)現(xiàn)，地黃飲子具有改善患者疲勞狀態(tài)的功效，實驗研究結(jié)果顯示地黃飲子可以增加雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的含量，降低丙二醛（MDA）的含量[2];能通過保護線粒體結(jié)構(gòu)功能，改善細(xì)胞能量代謝[3];可降低腦組織中脂褐素含量，提高大鼠抗氧化能力[4]。本文在此基礎(chǔ)上研究地黃飲子對運動性疲勞小鼠運動能力的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物與藥物

選用清潔級雄性昆明小鼠30只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（黑）2019-001，體質(zhì)量為（28±2） g，8周齡。飼養(yǎng)于自然光照條件下，20～25 ℃，自由進(jìn)食。地黃飲子水煎液由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論實驗室提供，地黃飲子組成：熟地黃、石斛、山茱萸、肉蓯蓉、巴戟天、五味子、麥冬、肉桂、遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓各15 g，炮附子、薄荷、生姜各5 g，大棗1枚。加10倍水浸泡1 h，砂鍋煎煮1 h后倒出藥液，按照上述步驟將藥物再煎煮1次;將2次濾出的藥液混合并濃縮成1.85 g/mL的生藥濃度，高壓滅菌后放入4 ℃冰箱備用。

1.2? 動物分組及給藥方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為安靜對照組（安靜組）、疲勞模型組（模型組）和地黃飲子組，每組10只小鼠。常規(guī)飼料喂養(yǎng)外，地黃飲子組每天給予24.05 g/kg的地黃飲子水煎液灌胃，安靜組和模型組給予等劑量的蒸餾水灌胃，共灌胃4周。

1.3? 主要儀器

ELITE 300PLUS基礎(chǔ)電泳儀電源、Yrdimes SW

07D0567蛋白印跡儀、Dolphin系列凝膠成像系統(tǒng)均購自威泰克有限公司;5415C高速冷凍離心機（德國 eppendorf公司）;UV-2540分光光度計（日本 SHIMAZDU公司）;THZ-312臺式恒溫振蕩器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;BL310/BL21S分析天平（德國Sartorius公司）。

1.4? 主要實驗試劑

睪酮、皮質(zhì)醇檢測試劑盒（20190107），MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒（20190320），檢測試劑盒（20190312）均購于中國南京建成生物工程研究所。全蛋白抽提試劑盒（KGP2100）、Western及IP細(xì)胞裂解液（KGP701）、SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒（KGP113）、BCA蛋白含量檢測試劑盒（KGP903）購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;Invent總蛋白提取試劑盒（Invent SD001/SN002）購于英文特生物技術(shù)股份有限公司;ECL檢測試劑盒（Millopore WBKLS0100）購于德國默克公司。

1.5? 動物模型制備

除安靜組外，另兩組每天進(jìn)行游泳訓(xùn)練，在直徑為100 cm、深度為60 cm的圓形游泳池內(nèi)進(jìn)行，水溫為（30±2） ℃，每周游泳訓(xùn)練6 d，休息1 d，訓(xùn)練時間為每天60 min，訓(xùn)練4周。

1.6? 取材

在力竭游泳后即刻取材，各組小鼠采用眼眶取血，采血后立刻斷頸、解剖，取肝和股直肌，生理鹽水洗凈，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。血液樣本離心后取上清液，-80 ℃冰箱保存待測。

1.7? 指標(biāo)檢測

1.7.1? 體質(zhì)量稱量? 開始游泳訓(xùn)練前每組小鼠稱體質(zhì)量，開始訓(xùn)練后，于每周的造模休息日稱體質(zhì)量，最后一周取材前稱體質(zhì)量。

1.7.2? 力竭游泳時間? 記錄模型組和地黃飲子組小鼠從開始游泳至四肢出現(xiàn)不協(xié)調(diào)，頭部全部沉入水中5 s不能自主浮出水面，取出水后不能自由抬起頭的時間，即為力竭游泳時間。

1.7.3? 血清血睪酮、皮質(zhì)醇、尿素氮含量測定? 離心后的血清，嚴(yán)格按照睪酮、皮質(zhì)醇、尿素氮的檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，測定各指標(biāo)的數(shù)值，記錄并分析。

1.7.4? 肝組織抗氧化酶活性測定? 取肝組織天平稱重后，置于冷生理鹽水中，制成10%的勻漿，離心后取上清液，用BCA法蛋白定量后，按照試劑盒說明書的操作步驟來檢測各組小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.7.5? Western blot法檢測股直肌中AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)水平? 用Invent試劑盒提取股直肌組織蛋白，低溫操作;采用BCA法檢測股直肌組織蛋白濃度，各管試劑充分混勻，37 ℃放置30 min，記錄吸光值;配制SDS-PAGE的分離膠后，將SDS-PAGE的濃縮膠注入分離膠的上端，插入與玻璃板厚度相適應(yīng)的樣品梳子，避免產(chǎn)生氣泡，開始電泳;電壓開始設(shè)置為60 V，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠后，電壓提高到90 V，參照預(yù)染Marker 的位置，待目的條帶進(jìn)入凝膠的2/3時，停止電泳;預(yù)先將轉(zhuǎn)膜液4 ℃預(yù)冷，轉(zhuǎn)印夾層依次形成“纖維墊—濾紙—凝膠—NC/PVDF膜—濾紙—纖維墊”層次，關(guān)閉轉(zhuǎn)印夾，放入轉(zhuǎn)移槽中;穩(wěn)流200 mA，90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC/PVDF膜并作好標(biāo)記;封閉，蛋白上樣量40 μg，AMPK和PGC-1α（1∶500）、Actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜;羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（1∶5 000）常溫孵育2 h，免疫印跡完成;用ECL化學(xué)發(fā)光試劑配置的工作液滴在NC/PVDF膜上，凝膠成像儀成像;用Gel-Pro Analyzer 4軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.8? 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對本次研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料用“x±s”表示，組間采用單因素方差分析進(jìn)行比較，差異顯著性水平定義為P<0.05，若3組之間差異具有顯著性，則進(jìn)行多重比較，由于每組樣本量相同，故采用Tukey Test進(jìn)行多重比較。兩組之間進(jìn)行比較，則采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1? 各組小鼠體質(zhì)量變化比較

安靜組與模型組比較，體質(zhì)量具有顯著性差異（P<0.05）;地黃飲子組與模型組比較，體質(zhì)量具有顯著性差異（P<0.05）。見表1。

2.2? 各組小鼠力竭時間比較

地黃飲子組與模型組比較，力竭游泳時間明顯延長（P<0.05）。見表1。

2.3? 各組小鼠血睪酮、皮質(zhì)醇、尿素氮水平比較

模型組與安靜組比較，血睪酮含量明顯降低（P<0.05）;皮質(zhì)醇、尿素氮含量顯著升高（P<0.05）。地黃飲子組與模型組比較，血睪酮含量明顯升高（P<0.05），皮質(zhì)醇、尿素氮含量顯著降低（P<0.05）。見表2。

2.4? 各組小鼠肝組織SOD、MDA、GSH-Px水平比較

與安靜組比較，模型組肝組織SOD、GSH-Px含量明顯降低（P<0.05），MDA含量顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，地黃飲子組SOD、GSH-Px含量明顯升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。見表3。

2.5? 各組小鼠股直肌中AMPK、PGC-1α蛋白表達(dá)水平比較

與安靜組比較，模型組股直肌中AMPK、PGC-1α的表達(dá)是明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，地黃飲子組的AMPK、PGC-1α表達(dá)量明顯升高（P<0.05）。見表4、圖1。

3 討論

地黃飲子出自金代劉完素的《黃帝素問宣明論方》，由15味中藥組成，功效為滋腎陰、補腎陽、開竅化痰，是陰陽雙補的代表方之一?，F(xiàn)代研究表明地黃飲子藥物血清可能通過抑制RAGE/ROS氧化應(yīng)激通路激活，減少ROS的產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化作用[5]。周妍妍等[6]研究證實地黃飲子含藥腦脊液可以顯著抑制Aβ導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)元及PC12細(xì)胞中SOD、GSH-Px和過氧化氫酶（CAT）活性下降，降低MDA水平，提高細(xì)胞抗氧化能力。

當(dāng)運動性疲勞發(fā)生時，體內(nèi)會出現(xiàn)比較復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，表現(xiàn)出運動能力和耐力的下降及機體供能不足;力竭時間是衡量機體運動能力的重要直接指標(biāo)[7];皮質(zhì)醇與機體的運動強度和運動時間密切相關(guān);血睪酮含量會因長時間的運動，合成分泌受到抑制，出現(xiàn)運動性低睪酮現(xiàn)象[8]，從而降低機體的運動能力。有效清除自由基，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)是減輕運動性疲勞的方法之一[9]，SOD活性的高低能間接反映機體清除自由基的能力[10];GSH-Px能夠使谷胱甘肽由還原型轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸?，是衡量機體抗氧化能力的重要因素[11];MDA含量可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度[12]。血清尿素氮的升高標(biāo)志著糖原已經(jīng)消耗殆盡，機體已經(jīng)依靠蛋白質(zhì)的分解供能[13]。

AMPK是調(diào)節(jié)能量代謝的關(guān)鍵因子，是敏感的能量變化感應(yīng)系統(tǒng)[14]。AMPK參與機體多種物質(zhì)能量代謝過程，當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)（如缺血、缺氧、運動等）時，AMPK激酶系統(tǒng)將啟動，增加葡萄糖轉(zhuǎn)運和脂肪酸氧化等代謝過程，同時阻斷糖異生、蛋白質(zhì)合成以及脂類等代謝過程[15]。因此，氧化應(yīng)激和細(xì)胞能量代謝的改變可激活A(yù)MPK[16]。PGC-1α在脂肪酸氧化、葡萄糖代謝、線粒體生物合成等方面有重要的調(diào)控作用。PGC-1α通過激活編碼線粒體基因的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，提高體內(nèi)能量代謝酶的活性，從而提高骨骼肌的抗疲勞能力[17]42。有實驗發(fā)現(xiàn)[17]45，三仙湯能明顯提高肌肉組織的PGC-1α蛋白表達(dá)量，提高了機體物質(zhì)轉(zhuǎn)化能量的速率，使供能物質(zhì)的合成加速。有研究報道[18]，小建中湯有緩解運動性疲勞的作用，可能的作用機制是通過提高骨骼肌中AMPK/PGC1-α信號通路的蛋白表達(dá)，增強了線粒體的氧化磷酸化過程，減少了代謝產(chǎn)物的堆積，增強了骨骼肌能量合成代謝。有研究證實[19]，一些代謝疾病中，出現(xiàn)線粒體功能障礙后，AMPK/PGC-1α信號通路受到明顯抑制。當(dāng)機體出現(xiàn)運動性疲勞時，AMPK和PGC-1α表達(dá)也受到抑制，能量代謝通路受阻，機體能量供應(yīng)不足，代謝產(chǎn)物不能及時清除，因此，提高AMPK和PGC-1α的表達(dá)能夠在一定程度上緩解運動性疲勞。

本實驗中，與模型組比較，地黃飲子組小鼠體質(zhì)量增加明顯（P<0.05），表明模型組小鼠的能量代謝快，體質(zhì)量增長慢，疲勞程度重;力竭游泳時間明顯延長（P<0.05），表明地黃飲子組小鼠的運動耐力更強;血睪酮含量明顯升高（P<0.05），表明地黃飲子組小鼠的運動能力更強;皮質(zhì)醇、尿素氮含量顯著降低（P<0.05），表明地黃飲子組小鼠的耐受的運動強度和運動負(fù)荷更高;肝組織GSH-Px、SOD活性顯著增強（P<0.05），MDA含量明顯降低（P<0.05），表明地黃飲子組小鼠清除自由基和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力更強。AMPK、PGC-1α的蛋白表達(dá)升高（P<0.05），表明地黃飲子組小鼠通過AMPK/PGC-1α信號通路調(diào)控能量代謝的能力更強，能夠在一定程度緩解小鼠運動性疲勞的狀態(tài)。

綜上所述，地黃飲子可能是通過降低運動性疲勞模型小鼠血皮質(zhì)醇、尿素氮、MDA含量，提高GSH-Px、SOD活性和血睪酮的含量，提高AMPK、PGC-1α的蛋白表達(dá)水平，在一定程度上增強運動性疲勞模型小鼠的運動耐力、運動強度和運動負(fù)荷，增加清除自由基和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的能力，提高肌肉組織的物質(zhì)代謝的能力，從而提升機體運動能力和加速疲勞恢復(fù)，起到緩解運動性疲勞的作用。

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