藥根堿靶向凝血因子Ⅻ發(fā)揮抗凝血作用的體外研究

劉惠娜　李艷玲　曹旺　鄧常清

〔摘要〕 目的 以凝血因子Ⅻ （coagulation factor Ⅻ， FⅫ）為靶點探討藥根堿抗血栓作用的機制。方法 通過Ledock軟件將藥根堿分子與內(nèi)源性凝血途徑接觸激活階段關(guān)鍵靶蛋白FⅫ、活化凝血因子FⅫ （actived coagulation factor Ⅻ， FⅫa）、凝血因子Ⅺ （coagulation factor Ⅺ， FⅪ）和活化凝血因子Ⅺ （actived coagulation factor Ⅺ， FⅪa）進行分子對接，以結(jié)合能低于-5 kcal/mol作為閾值判斷藥根堿與接觸激活因子的結(jié)合活性;采用體外凝血實驗法檢測血漿活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time， APTT）、血漿凝血酶原時間（plasma prothrombin time， PT）、凝血酶時間（plasma prothrombin time， TT）;乏因子血漿糾正試驗檢測FⅫ、FⅪ、凝血因子Ⅸ （coagulation factor Ⅸ， FⅨ）、凝血因子Ⅷ （coagulation factor Ⅷ， FⅧ）、凝血因子Ⅹ （coagulation factor Ⅹ， FⅩ）和凝血因子Ⅶ （coagulation factor Ⅶ， FⅦ）的活性的抑制作用;Western blot法檢測藥根堿對FⅫ蛋白激活的抑制作用。結(jié)果 （1）分子對接實驗表明，藥根堿與FⅫa、FⅪa結(jié)合能均低于-5 kcal/mol，結(jié)合活性良好。（2）體外實驗中，0.2～0.8 mg/mL藥根堿均可顯著延長APTT （P<0.01），但不延長PT和TT （P>0.05）。（3）藥根堿各劑量均顯著降低FⅫ活性（P<0.01），藥根堿高劑量（0.8 mg/mL）可降低FⅪ活性（P<0.05），但對FⅨ、FⅧ、FⅩ及FⅦ活性無顯著影響（P>0.05）。（4）藥根堿各劑量均顯著抑制FⅫ蛋白的激活（P<0.01）。結(jié)論 藥根堿與FⅫa對接較好，顯著延長APTT，抑制FⅫ蛋白激活，降低血漿FⅫ活性，提示其抗栓作用可能通過抑制FⅫ的活性而發(fā)揮。

〔關(guān)鍵詞〕 藥根堿;內(nèi)源性凝血途徑;凝血因子Ⅻ;分子對接

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.01.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the anticoagulant mechanism of jatrorrhizine with coagulation factor Ⅻ（FⅫ） as the target. Methods Factor Ⅻ （FⅫ）， actived coagulation factor Ⅻ （FⅫa）， coagulation factor Ⅺ （FⅪ） and actived coagulation factor Ⅺ （FXIa）， which are the key target proteins in the contact activation stage of endogenous coagulation pathway， were performed molecular docking with jatrorrhizine by the Ledock software， the binding activity between jatrorrhizine and contact activation factors was determined by the threshold that binding energy lower than -5 kcal/mol; the activated partial thromboplastin time （APTT）， prothrombin time （PT） and thrombin time （TT） were detected by vitro coagulation test; the inhibitory effect of jatrorrhizine on the activities of FⅫ， FⅪ， coagulation factors Ⅸ （FⅨ）， coagulation factors Ⅷ （FⅧ）， coagulation factors Ⅹ （FⅩ） and coagulation factors Ⅶ （FⅦ） was detected by factor deficient plasma correction test; Western blot was used to detect the inhibitory effect of jatrorrhizine on activation of FⅫ protein. Results （1） The molecular docking experiments showed that the binding energies of jatrorrhizine with FⅫa and FXIa were lower than -5 kcal/mol， which indicated high binding activity. （2） Jatrorrhizine prolonged APTT at 0.2-0.8 mg/mL （P<0.01）， but did not prolong PT and TT （P>0.05） in vitro experiment. （3） Various concentration of jatrorrhizine significantly decreased the activity of FⅫ （P<0.01）， high concentration of jatrorrhizine （0.8 mg/mL） decreased the activity of FⅪ （P<0.05）， but? had no significant effect on the activities of FⅨ， FⅧ， FⅩ and FⅦ （P>0.05）. （4） Various concentration of jatrorrhizine significantly inhibited the activity of? FⅫ protein（P<0.01）. Conclusion Jatrorrhizine has a good docking with FⅫa. It can significantly prolong APTT， inhibit activation of FⅫ protein and reduce the activity of plasma FⅫ. All suggested that antithrombotic effect of jatrorrhizine may be exerted by inhibiting the activity of FⅫ.

〔Keywords〕? jatrorrhizine; endogenous coagulation pathway; coagulation factor Ⅻ; molecular docking

血栓形成是嚴重威脅人類健康的一種病理過程。以血栓形成為基本病理特征的心腦血管疾病如中風(fēng)、心肌梗死等，起病急、病情重、死亡率高，占非傳染性疾病總死亡率的44%，已成為我國人口死亡與致殘的首位原因[1]。目前，應(yīng)用的抗血栓藥可分為抗血小板藥、抗凝血藥和溶血栓藥三大類[2]。隨著人們對血栓形成機制的不斷深入了解，以直接抑制凝血酶或抑制凝血因子Xa為作用靶點的抗栓藥物也逐漸普及，但這些藥物均干擾生理性止血過程，存在較嚴重的出血不良反應(yīng)[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抑制內(nèi)源性凝血途徑的接觸激活因子凝血因子Ⅻ （coagulation factor Ⅻ， FⅫ）、凝血因子Ⅺ （coagulation factor Ⅺ， FⅪ）、前激肽釋放酶（prekallikrein， PK）或高分子激肽原（high molecular weight kininogen， HK）具有顯著的抗血栓效果卻無明顯的出血不良反應(yīng)[4-6]，提示內(nèi)源性凝血途徑的接觸激活因子有望成為抗血栓藥物的重要靶點。許多中草藥和復(fù)方特別是活血化瘀類中藥均能有效地防治血栓性疾病，主要是從抗血小板、抗凝血酶和促纖溶等方面發(fā)揮作用，確有療效且安全的以接觸激活因子為靶點的抗栓藥物還不多。

藥根堿（jatrorrhizine）是從毛茛科植物黃連、小檗科植物功勞木及防己科植物青牛膽等植物中提取出來的異喹啉類生物堿，其結(jié)構(gòu)與小檗堿類似。藥根堿及其衍生物具有抑制炎癥、降血糖、降血脂、抗風(fēng)濕、抗腫瘤等藥理作用[7-9]，但其抗血栓作用的研究尚未涉及。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，藥根堿靜脈注射可延長頸動脈血栓模型血管閉塞時間，減輕動脈血栓和靜脈血栓模型的血栓重量，但不顯著延長小鼠尾出血時間，提示藥根堿具有確切的抗動脈血栓和靜脈血栓形成的作用，出血不良反應(yīng)輕，其作用機制可能是通過抑制凝血因子特別是內(nèi)源性凝血途徑的凝血因子活性而發(fā)揮作用[10]。為進一步研究藥根堿抗血栓作用的機制，本研究從凝血因子活性探討藥根堿對凝血因子的抑制作用，明確其可能的作用靶點，為進一步揭示其作用機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1? 試驗藥物

藥根堿（jatrorrhizine，CAS 3621-38-3，批號PRF908

0441），質(zhì)量分數(shù)≥95%，購自成都普法瑞科技開發(fā)有限公司。低分子肝素鈉（達肝素，dalteparin sodium， CAS

9041-08-1，批號MB1914）購自大連美侖生物公司，每克抗因子Xa活性效價為133 000 U，使用時用生理鹽水配制。玉米胰蛋白酶抑制劑（corn trypsin inhibitor，CTI，批號1018）購自美國Molecular Innovations公司。

1.2? 動物

新西蘭大白兔，雄性，體質(zhì)量1.6～2.0 kg，動物許可證號：SCXK（湘）2015-0004，購自湖南太平生物科技有限公司。動物實驗在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心完成，實驗場地許可證號：SYXK（湘）2013-0005。動物的使用符合科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定。

1.3? 主要試劑和儀器

高嶺土（kaolin，批號93-1348），購自美國Strem Chemicals公司。血漿活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time， APTT，批號253259）試劑、凝血酶原時間（prothrombin time， PT，批號253305）試劑、凝血酶時間（thrombin time， TT，批號252465）試劑、纖維蛋白原（fibrinogen， FIB，批號252569）試劑及質(zhì)控品（批號12351，253868）、定標品（批號253180）、乏因子Ⅻ血漿（deficient Ⅻ plasma， 批號250883）、乏因子Ⅺ血漿（deficient Ⅺ plasma， 批號252200）、乏因子Ⅸ血漿（deficient Ⅸ plasma， 批號253639）、乏因子Ⅹ血漿（deficient Ⅹ plasma， 批號251434）、乏因子Ⅶ血漿 （deficient Ⅶ plasma， 批號252767）均購自法國斯塔高公司。乏因子Ⅷ血漿（deficient Ⅷ plasma， 批號547676）購自希森美康醫(yī)用電子有限公司。FⅫ蛋白（factor Ⅻ protein，批號7690-250）購自美國Biovision公司。FⅫ抗體（anti-factor Ⅻ，批號ab242123）購自Abcam公司。HRP標記的羊抗兔二抗，批號AT0097，購自美國CMCTAG公司。TBST緩沖液（批號MA0091）、WB脫脂牛奶封閉液（批號MA0097）、飛克特超敏ECL液（批號MA0186）均購自大連美侖生物公司。

STA Compact Max 全自動凝血分析儀（法國斯塔高公司）; CS-5100全自動凝血分析儀（希森美康醫(yī)用電子有限公司）。

1.4? 方法

1.4.1? 分子對接法評估藥根堿與接觸激活因子FⅫ、FⅪ的結(jié)合活性? 從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank， PDB）中下載相應(yīng)靶標蛋白的PDB文件：FⅫ對應(yīng)的PDB_ID為4bdx，F(xiàn)Ⅻa對應(yīng)的PDB_ID為4xe4，F(xiàn)Ⅺ對應(yīng)的PDB_ID為5eok，F(xiàn)XIa對應(yīng)的PDB_ID為4d76。選擇靶標蛋白上的配體分子再通過pymol的GetBox Plugin計算對接盒子，再使用該對接盒子通過Ledock軟件進行靶標受體蛋白去配體、離子、水等預(yù)處理后，導(dǎo)入FⅫ、FⅫa、FⅪ和FⅪa，并分別通過Ledock軟件與藥根堿分子進行對接，對接結(jié)果通過pymol進行可視化。評估藥根堿分子和靶標蛋白的結(jié)合活性，以結(jié)合能低于-5 kcal/mol作為閾值[11]，結(jié)合能越低，則表明結(jié)合活性越好。

1.4.2? 凝固法檢測藥根堿在體外對APTT、PT、TT、FIB的影響? 新西蘭兔7只，采血前12 h禁食不禁水。將家兔仰臥固定，在左側(cè)胸部心臟部位去毛、消毒，于第3肋間胸骨左緣3 mm心尖處將注射針垂直刺入心臟采血，然后與3.8%枸櫞酸鈉混勻抗凝，3 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液即兔貧血小板血漿（platelet poor plasma， PPP），分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將超純水、不同濃度藥根堿、低分子肝素分別加入同一家兔PPP，編組為空白組、藥根堿低劑量組（0.2 mg/mL）、藥根堿中劑量組（0.4 mg/mL）、藥根堿高劑量組（0.8 mg/mL）和肝素組（3.125 IU/mL），采用全自動凝血分析儀測定APTT、PT、TT和FIB。

1.4.3? 乏因子血漿糾正試驗檢測藥根堿在體外對凝血因子活性的抑制效應(yīng)? 為了檢驗藥根堿對凝血途徑影響的具體作用因子，采用乏因子血漿糾正試驗測定凝血因子活性，其活性是通過待測血漿糾正乏因子血漿的能力而測得。分組同“1.4.2”，將待測血漿分別與凝血因子活性測定試劑盒（即缺乏FⅫ、FⅪ、FⅨ、FⅧ、FⅩ、FⅦ的血漿）混合，然后應(yīng)用全自動血凝儀測定血漿FⅫ、FⅪ、FⅨ、FⅧ、FⅩ、FⅦ活性。

進一步檢驗藥根堿與FⅫ抑制劑是否具有相似效應(yīng)，將超純水、不同濃度藥根堿、CTI（FⅫ抑制劑）分別加入同一家兔PPP，編組為空白組、藥根堿低劑量組（0.2 mg/mL）、藥根堿中劑量組（0.4 mg/mL）、藥根堿高劑量組（0.8 mg/mL）和抑制劑組（0.025 mg/mL）。然后采用乏因子血漿糾正試驗測定凝血因子Ⅻ活性。

1.4.4? Western blot法檢測藥根堿在體外對FⅫ蛋白激活的抑制作用? 將等容積超純水、FⅫ抑制劑、藥根堿（1.8 mg/mL）、藥根堿（2.4 mg/mL）分別加入等容積同一濃度的FⅫ蛋白（0.25 mg/mL）中，編組為空白組、抑制劑組（0.25 mg/mL）、藥根堿低劑量組、藥根堿高劑量組，然后37 ℃孵育5 min后，加入FⅫ激活物高嶺土（5 mg/mL），再37 ℃孵育5 min，10 000 r/min離心5 min，取上清，加入5×上樣緩沖液，沸水煮10 min后，上樣（每孔10 μL）、電泳2.5 h、轉(zhuǎn)膜2 h、封閉2 h，然后FⅫ抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，孵二抗1.5 h后顯影。用Image Pro-Plus

6.0分析軟件計算各組累積光密度值（integrated optical density， IOD）。FⅫ蛋白在未激活狀態(tài)下以80 kDa酶原形式存在，被激活后裂解。本實驗在不同干預(yù)因素處理后，檢測80 kDa FⅫ酶原含量來判斷FⅫ的激活情況。80 kDa FⅫ蛋白IOD值越高，即FⅫ酶原含量越高，表明被激活的FⅫ蛋白越少。

1.5? 統(tǒng)計學(xué)分析與方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)計量資料以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnetts T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 藥根堿與接觸激活因子FⅫ、FⅪ的結(jié)合活性? 藥根堿占據(jù)了FⅫa蛋白中由GLN-489、GLY-374、ARG-413、TYR-372等殘基構(gòu)成的活性空腔，其分子與FⅫa的GLN-489殘基形成了2個氫鍵，與GLY-374殘基形成1氫鍵，與TYR-372形成了2個π堆積，與ARG-413形成了1個π陽離子相互作用，且藥根堿與FⅫa結(jié)合能低于-5 kcal/mol，具有強親和力。藥根堿占據(jù)了FⅪa蛋白中由LYS-192、ASP-189等殘基構(gòu)成的活性空腔，其分子與FⅪa的ASP-189殘基形成了1個氫鍵，與LYS-192殘基形成1個疏水鍵，且藥根堿與FⅪa親和能低于-5 kcal/mol，具有較強親和力。分子對接結(jié)果表明，藥根堿分子可與FⅫa、FⅪa結(jié)合，可能對FⅫa、FⅪa活性具有抑制作用。見表1、圖1。

2.2? 藥根堿對兔血漿APTT、PT、TT、FIB的影響

與空白組比較，藥根堿各劑量組均可顯著延長APTT（P<0.01），但不延長PT、TT（P>0.05）。低分子肝素顯著延長APTT、TT（P<0.01）。藥根堿各劑量和低分子肝素對PT、FIB含量無顯著影響（P>0.05）。見圖2。

2.3? 藥根堿在體外對兔血漿凝血因子活性的影響

2.3.1? 藥根堿對兔血漿FⅫ、FⅪ、FⅨ、FⅧ、FⅩ及FⅦ活性的影響? 與空白組比較，藥根堿各劑量組均可顯著降低FⅫ因子活性（P<0.01）;藥根堿高劑量組可降低FⅪ因子活性（P<0.05）;但藥根堿各劑量組對FⅨ、FⅧ、FⅩ及FⅦ因子活性無顯著影響（P>0.05）。低分子肝素可顯著降低FⅫ、FⅪ、FⅨ及FⅧ因子活性（P<0.01），但對FⅩ及FⅦ因子活性無顯著影響（P>0.05）。見圖3。

2.3.2? 藥根堿對兔血漿FⅫ活性的影響? 與空白組比較，藥根堿各劑量組可顯著降低FⅫ因子活性（P<0.01），抑制劑組可顯著降低FⅫ因子活性（P<0.01）。與抑制劑組比較，藥根堿各劑量組FⅫ因子活性無顯著差異（P>0.05），表明藥根堿具有類似FⅫ抑制劑效應(yīng)。見圖4。

2.4? 藥根堿對FⅫ蛋白激活的影響

空白組FⅫ蛋白IOD為0，表明沒有抑制劑作用，F(xiàn)Ⅻ全部被高嶺土激活。與空白組比較，抑制劑組和藥根堿組FⅫ蛋白IOD值均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。說明藥根堿和抑制劑都能抑制高嶺土對FⅫ蛋白的激活。見圖5。

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn)通過基因剔除實驗抑制內(nèi)源性凝血途徑的接觸激活因子FⅫ、FⅪ可抑制閉塞性血栓形成。且抑制FⅫ無出血傾向，抑制FⅪ的出血傾向遠遠低于FⅧ和FⅨ缺陷，提示接觸激活因子FⅫ、FⅪ參與促進血栓形成的病理過程，卻不是生理止血所必需的[12-14]。在血栓形成過程中，以FⅫ為起點的內(nèi)源性凝血途徑的瀑布反應(yīng)，產(chǎn)生大量凝血酶，進而產(chǎn)生大量纖維蛋白，使血栓增殖、穩(wěn)固，從而產(chǎn)生閉塞性血栓。因此，以FⅫ為起點的內(nèi)源性凝血途徑的激活是血栓形成與穩(wěn)定的關(guān)鍵。諸多實驗亦證實，基因剔除FⅫ（FⅫ-/-）小鼠可以抑制FeCl3誘導(dǎo)的頸總動脈和腸系膜動脈血栓形成，而注射FⅫ后，血栓就快速形成[15-17]。在下腔靜脈結(jié)扎血栓模型，F(xiàn)Ⅻ-/-同樣可以抑制深靜脈血栓形成[18]。由此，接觸激活因子FⅫ有望成為抗栓藥物的新靶點[19]，并且以FⅫ為靶點的抗血栓研究已取得一定進展。Yau J W等[20]通過寡義反核苷酸技術(shù)ASO下調(diào)FⅫ表達，可顯著抑制小鼠下腔靜脈結(jié)扎的血栓形成和FeCl3誘導(dǎo)的腸系膜動脈血栓形成，且同時對尾出血時間并無顯著影響。但通過ASO下調(diào)FⅫ需要的時間長，起效慢，且存在脫靶可能。來源于騷擾蝽中腸的重組FⅫa的競爭性抑制物rHA-infestin-4具有明顯的抗栓效果[21]，但rHA-infestin-4在高濃度時抑制FXa活性和纖溶酶[22]。可以口服的小分子 FⅫa抑制劑如3-甲酰胺香豆素適合長期抗栓應(yīng)用，但都有待進一步研究[23]。

中醫(yī)藥防治心腦血管血栓性疾病療效肯定，相比目前常用的抗血栓藥，中草藥可以從多途徑、多靶點發(fā)揮抗血栓作用，且作用平和，不良反應(yīng)少。但以往多是從保護血管內(nèi)皮細胞（vascular endothelial cell， VEC）、增加VEC抗血栓形成，抑制血小板黏附、聚集、釋放，增強抗凝、促進纖溶等方面進行研究[24-26]，且對這些藥物抗栓的作用機制研究還存在諸多不足。因此，進一步從天然產(chǎn)物中尋找以FⅫ為靶點的抗血栓藥物具有重要的應(yīng)用價值。

為進一步研究藥根堿抗血栓作用機制，探討其是否可以通過抑制內(nèi)源性凝血途徑的激活而發(fā)揮抗血栓的作用，尋找其抗栓作用的可能靶點，本研究將藥根堿分子與接觸激活關(guān)鍵靶蛋白FⅫ、FⅫa、FⅪ和FⅪa通過Ledock軟件進行分子對接，結(jié)果顯示藥根堿與FⅫa、FⅪa活性中心對接良好，提示藥根堿可能對FⅫa、FⅪa具有抑制作用。進而通過體外實驗檢測藥根堿對家兔血漿APTT、PT、TT和FIB的影響，發(fā)現(xiàn)藥根堿可顯著延長APTT，但不延長PT和TT，而APTT是反映內(nèi)源性凝血途徑凝血活性的指標，提示藥根堿可能通過與FⅫa、FXIa的活性中心結(jié)合而抑制內(nèi)源性凝血途徑的活性，從而延長APTT。我們進一步通過乏因子血漿糾正試驗分析了藥根堿對凝血過程中主要因子FⅫ、FⅪ、FⅨ、FⅧ、FⅩ和FⅦ活性的影響，結(jié)果顯示不同濃度藥根堿均顯著降低FⅫ活性，其對FⅫ的抑制作用與CTI（FⅫ抑制劑）類似，且高濃度藥根堿對FⅪ活性亦有抑制作用，但不影響FⅨ、FⅧ、FⅩ和FⅦ的活性，而抗凝藥物肝素可顯著降低FⅫ、FⅪ、FⅨ及FⅧ的活性，說明藥根堿可能主要抑制內(nèi)源性接觸激活因子FⅫ的活性，通過FⅫ影響全程的接觸激活內(nèi)源性凝血途徑，對其他凝血因子活性影響較小，其作用不同于肝素，不會導(dǎo)致嚴重的出血不良反應(yīng)。采用Westernblot法檢測藥根堿在體外對FⅫ蛋白激活的抑制作用，結(jié)果顯示藥根堿和CTI類似，均能顯著抑制高嶺土對FⅫ蛋白的激活。進一步說明藥根堿可能以FⅫ為靶點，通過與FⅫ蛋白結(jié)合，抑制其激活而抑制內(nèi)源性凝血途徑，從而發(fā)揮抗凝血抗栓作用。

綜上所述，藥根堿具有確切的抗血栓作用，其與FⅫa對接良好，可顯著延長APTT，通過抑制FⅫ蛋白激活，降低血漿FⅫ活性，其作用與肝素不同，且不影響血小板、抗凝和纖溶，表明藥根堿可能主要作用于內(nèi)源性凝血系統(tǒng)，可能通過抑制FⅫ蛋白激活、降低FⅫ活性而發(fā)揮抗栓作用，但具體的作用形式有待進一步闡明。

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