丙泊酚對(duì)睡眠剝奪大鼠甲狀腺PI3K/Akt通路及細(xì)胞凋亡的影響 *

李 麗，劉金柱

(天津市兒童醫(yī)院/天津大學(xué)兒童醫(yī)院麻醉科 300101)

睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)是指由于各種原因引起的機(jī)體睡眠不足，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)焦慮煩躁、心腦血管意外、免疫功能下降、抑郁自殺等癥狀[1]。近年來(lái)，SD也逐漸成為臨床研究熱點(diǎn)之一[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)SD可導(dǎo)致甲狀腺功能受損，并引起機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)、器官、組織功能異常[3-4]，而甲狀腺可維持機(jī)體各系統(tǒng)、器官和組織的正常功能[5]，故研究SD過(guò)程中甲狀腺細(xì)胞的功能狀態(tài)，對(duì)闡明SD機(jī)制和改善SD患者身心健康，具有一定的潛在意義。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡等多種細(xì)胞生理活動(dòng)，且參與甲狀腺癌、甲狀腺功能減退等病理過(guò)程，是近來(lái)研究的熱點(diǎn)通路之一[6-7]。然而，PI3K/Akt通路在SD過(guò)程中的調(diào)控作用，研究卻相對(duì)較少。丙泊酚為短效靜脈麻醉藥，具有鎮(zhèn)靜催眠作用，有研究顯示，丙泊酚可參與協(xié)調(diào)大腦皮質(zhì)交流和運(yùn)行，并改善睡眠障礙患者的睡眠狀況[8]。然而丙泊酚是否能夠通過(guò)影響SD患者甲狀腺功能，緩解睡眠不足引起的機(jī)體功能異常及不適癥狀，還未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立SD大鼠模型，探討丙泊酚對(duì)SD大鼠甲狀腺功能及PI3K/Akt通路的影響，以期闡明丙泊酚改善SD患者睡眠障礙的其他可能生物學(xué)機(jī)制，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物

清潔級(jí)同遺傳背景雄性Sprague Dawley大鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002。所有大鼠于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)為SYXK(津)2004-0001。飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，噪音低于80分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合3R原則。

1.1.2主要試劑及儀器

丙泊酚購(gòu)自北京凱瑞基生物科技有限公司(貨號(hào)：CY19852，規(guī)格：100 mg)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(貨號(hào)：G1120)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司(貨號(hào)：11684795910)；PI3K抗體、磷酸化Akt(p-Akt)抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體、B細(xì)胞白血病2(Bcl-2)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(貨號(hào)分別為：ab39307、ab38449、ab140882、ab196495)；BCA 蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Pierce公司(貨號(hào)分別為P0768、P0231)。手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司(型號(hào)RM2125RTS)；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司(型號(hào)SMZ745)；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司(型號(hào)1659001、Trans-Blot SD)；凝膠成像儀購(gòu)自杭州米歐儀器有限公司(型號(hào)GIS-500)。

1.2 方法

1.2.1大鼠SD模型建立及分組

選取大鼠50只分為正常組(Normal組)、SD模型組(SD組)、丙泊酚低劑量組(10 mg/kg)、丙泊酚中劑量組(25 mg/kg)、丙泊酚高劑量組(50 mg/kg)，每組10只。Normal組在正常條件下持續(xù)光照12 h+黑暗12 h模擬正常睡眠，其余各組大鼠均參照文獻(xiàn)[9]建立SD模型，具體操作方法：制作30 cm×30 cm×30 cm的玻璃箱，箱中有一直徑為6.3 cm、高 8.0 cm 的圓柱體平臺(tái)，在平臺(tái)周邊注滿水，水溫保持約20 ℃，水面距平臺(tái)面約1.0 cm，將大鼠放到小平臺(tái)上22 h，并蓋上籠蓋以防大鼠躥出，并給予持續(xù)日光燈照射，室內(nèi)溫度控制在18.0～22.0 ℃，大鼠在平臺(tái)上可自行飲食、飲水，若其睡眠，則由于肌肉張力松弛而落入水中，22 h后將大鼠取離平臺(tái)，給予正常黑暗環(huán)境，讓其自由活動(dòng)2 h后，重新放入小平臺(tái)中進(jìn)行SD 22 h，連續(xù)21 d后觀察大鼠行為狀態(tài)，若大鼠出現(xiàn)狂躁、易“激惹”及尖叫行為且毛色枯暗現(xiàn)象，表明造模成功。各組均于造模成功后開(kāi)始給藥，丙泊酚參照文獻(xiàn)[10]用生理鹽水配制成1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL的溶液，按10 mL/kg的劑量經(jīng)腹腔注射相應(yīng)劑量的丙泊酚溶液，Normal組及SD組按10 mL/kg的劑量經(jīng)腹腔注射生理鹽水。各組連續(xù)給藥7 d，每天1次。

1.2.2大鼠一般行為觀察

各組大鼠末次給藥12 h后，觀察毛色、飲食、精神狀態(tài)等一般行為，并稱取大鼠重量。

1.2.3大鼠標(biāo)本采集

各組大鼠末次給藥12 h后，麻醉，取腹主動(dòng)脈血，全自動(dòng)免疫分析儀(CLIA)及配套試劑盒用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定血清游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)、促甲狀腺激素(TSH)水平；處死大鼠，取甲狀腺，稱取重量后，剪取0.5 g組織，置于-80 ℃冰箱保存；其余組織迅速置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，備用。

1.2.4大鼠甲狀腺HE染色

4%多聚甲醛溶液中固定24 h的甲狀腺組織，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切成4 μm切片，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色，并在顯微鏡下觀察甲狀腺組織變化。

1.2.5TUNEL染色觀察甲狀腺細(xì)胞凋亡情況

石蠟切片經(jīng)脫蠟、脫水、封閉后添加TUNEL工作液室溫下孵育1 h，加入抗熒光猝滅劑進(jìn)行封片，在共聚焦顯微鏡下觀察切片中細(xì)胞凋亡情況，采用Image-pro plus定量細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6Western blot法檢測(cè)甲狀腺組織PI3K、p-Akt、caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

取-80 ℃保存的甲狀腺組織，于4 ℃冰箱中解凍后，用組織勻漿器勻漿，離心分離后，取上清液，蛋白提取試劑盒提取蛋白，蛋白定量BCA試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度后，取50 μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)。TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗(PI3K、p-Akt、caspase-3、Bcl-2、β-actin)，稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000)，4 ℃搖床室溫孵育過(guò)夜，TBST溶液清洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1∶2 000)，37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST溶液清洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般行為、體重、甲狀腺重量

Normal組大鼠行為活動(dòng)正常，毛色光澤柔順；與Normal組相比，SD組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、身體消瘦、皮毛無(wú)光澤，抓取時(shí)出現(xiàn)尖叫、狂躁行為，且體重和甲狀腺重量減輕(P<0.05)；與SD組大鼠相比，丙泊酚低、中、高劑量組精神萎靡、身體消瘦、皮毛無(wú)光澤，抓取時(shí)出現(xiàn)尖叫、狂躁行為減少，且體重和甲狀腺重量升高(P<0.05)，且丙泊酚各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體重和甲狀腺重量比較

2.2 各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平

與Normal組相比，SD組大鼠血清FT3、TSH水平升高(P<0.05)，F(xiàn)T4水平降低(P<0.05)；與SD組相比，丙泊酚低、中、高劑量組血清FT3、TSH水平降低(P<0.05)，F(xiàn)T4水平升高(P<0.05)，且丙泊酚各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠甲狀腺組織HE染色

Normal組大鼠甲狀腺形態(tài)正常，可見(jiàn)甲狀腺濾泡呈圓形或橢圓形,濾泡上皮細(xì)胞為單層立方狀，周圍可見(jiàn)毛細(xì)血管，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，濾泡腔內(nèi)充滿中等量粉紅色膠質(zhì)。與Normal組相比，SD組大鼠出現(xiàn)濾泡腔減小，濾泡上皮細(xì)胞呈扁平狀且排列紊亂，濾泡高度增生，形成無(wú)腔細(xì)胞團(tuán)等病理?yè)p傷。與SD組相比，丙泊酚各劑量組上述病理?yè)p傷程度逐漸減少，見(jiàn)圖1。

2.4 各組大鼠甲狀腺組織TUNEL染色

Normal組大鼠甲狀腺細(xì)胞染色正常。與Normal組相比，SD組大鼠細(xì)胞形狀不規(guī)則，大小不一，細(xì)胞核固縮且染色較深，棕黃色或棕色顆粒增多，且細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05)。與SD組相比，丙泊酚各劑量組細(xì)胞核染色較淺，棕黃色或棕色顆粒明顯減少，且細(xì)胞凋亡率呈劑量依賴性降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.5 各組大鼠甲狀腺組織PI3K、p-Akt、caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

與Normal組相比，SD組大鼠甲狀腺組織PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與SD組相比，丙泊酚低、中、高劑量組大鼠甲狀腺組織PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，且丙泊酚各劑量組上述指標(biāo)呈劑量依賴性，見(jiàn)圖3、表3。

表2 各組大鼠血清FT3、FT4、TSH水平比較

A:Normal組；B:SD組；C:丙泊酚低劑量組；D:丙泊酚中劑量組；E:丙泊酚高劑量組。

A:Normal組；B:SD組；C:丙泊酚低劑量組；D:丙泊酚中劑量組；E:丙泊酚高劑量組。

表3 各組大鼠甲狀腺組織PI3K、p-Akt、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)水平比較

A：Normal組；B：SD組；C：丙泊酚低劑量組；D：丙泊酚中劑量組；E：丙泊酚高劑量組。

3 討 論

SD會(huì)影響患者的攝食、飲水、排泄及新陳代謝等生理活動(dòng)，進(jìn)而影響患者體重和臟器指數(shù)。研究證實(shí)SD模型大鼠可出現(xiàn)體重減輕，脾臟、肺和心臟的臟器系數(shù)降低[11]及狂躁、易“激惹”、尖叫行為[12]。本研究發(fā)現(xiàn),SD組大鼠體重及甲狀腺重量明顯低于Normal組，且大鼠出現(xiàn)皮毛顏色變暗、狂躁、尖叫行為，表明造模成功。TSH可控制甲狀腺細(xì)胞大小及數(shù)目、甲狀腺激素合成，并調(diào)節(jié)甲狀腺功能，而FT3、FT4能夠精確反映機(jī)體激素水平[13]。睡眠不足患者存在下丘腦-垂體-甲狀腺軸的功能亢進(jìn)狀態(tài)[14]，而抑制甲狀腺功能亢進(jìn)狀態(tài)，可改善睡眠[15]。本研究每日對(duì)大鼠進(jìn)行SD 22 h，連續(xù)21 d后，SD組大鼠血清FT3、TSH水平升高，F(xiàn)T4水平降低，推測(cè)可能隨著SD時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)體調(diào)節(jié)能力難以代償，造成嚴(yán)重的內(nèi)分泌器官損傷，導(dǎo)致促甲狀腺激素受體分泌不足，TSH代償性升高，造成甲狀腺機(jī)能異常，F(xiàn)T4向FT3轉(zhuǎn)化增多，激素分泌紊亂。另外本研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠分泌器官甲狀腺出現(xiàn)濾泡腔減小、排列紊亂等病理?yè)p傷，且甲狀腺細(xì)胞凋亡率明顯高于Normal組，進(jìn)一步證實(shí)SD延長(zhǎng)會(huì)使甲狀腺分泌功能受損及激素分泌紊亂現(xiàn)象，這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)[9]一致。

丙泊酚是一種全身靜脈麻醉藥，被廣泛應(yīng)用于多種短小手術(shù)的麻醉和鎮(zhèn)靜。近年研究證實(shí)，丙泊酚可改善SD患者睡眠[8]。肖軍等[16]發(fā)現(xiàn)丙泊酚聯(lián)合刺五加注射液可改善SD大鼠睡眠狀況。本研究給予SD大鼠丙泊酚后，丙泊酚低、中、高劑量組大鼠體重、甲狀腺重量、FT4水平明顯高于SD組，F(xiàn)T3、TSH水平、甲狀腺細(xì)胞凋亡率均低于SD組且接近正常水平，大鼠毛色發(fā)暗、狂躁、尖叫行為及甲狀腺組織濾泡腔減小、排列紊亂等病理?yè)p傷明顯緩解，推測(cè)丙泊酚可能促進(jìn)大鼠睡眠，改善了因睡眠不足引起的甲狀腺功能損傷及激素分泌紊亂現(xiàn)象，表明丙泊酚可改善SD大鼠睡眠不足引起的甲狀腺組織損傷。然而其具體分子生物學(xué)機(jī)制還不甚明確。

PI3K/Akt信號(hào)通路為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)蛋白從而影響細(xì)胞的分化及存活[17]。研究證實(shí)甲狀腺炎患者炎癥因子IL-23升高，可抑制PI3K/Akt活化，促進(jìn)Akt下游促凋亡蛋白caspase-3表達(dá)，減少抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，而促進(jìn)甲狀腺上皮細(xì)胞凋亡，提示炎癥刺激可通過(guò)抑制PI3K/Akt通路激活，誘導(dǎo)甲狀腺上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)甲狀腺疾病的發(fā)生、發(fā)展[18]。機(jī)體受到SD刺激后，下丘腦-垂體-甲狀腺軸被激活，可使TSH釋放增多[19]，而TSH可與TSHR結(jié)合并通過(guò)激活腺苷酸環(huán)化酶上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，發(fā)揮抗凋亡和細(xì)胞增殖作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，SD組大鼠甲狀腺組織中PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)水平低于Normal組，caspase-3蛋白表達(dá)水平高于Normal組，提示SD大鼠甲狀腺組織中PI3K/Akt通路抑制，凋亡蛋白增加，然而這與TSH升高，促進(jìn)PI3K/Akt通路激活發(fā)揮抗凋亡作用相違背，推測(cè)可能由于隨著SD時(shí)間延長(zhǎng)，機(jī)體細(xì)胞調(diào)節(jié)能力難以代償，TSH過(guò)度在甲狀腺濾泡內(nèi)積聚，使內(nèi)分泌器官損傷嚴(yán)重，而TSH代償性升高可能仍不足以促進(jìn)PI3K/Akt通路激活發(fā)揮抗凋亡作用，這就解釋了TSH分泌過(guò)多與甲狀腺功能異常及甲狀腺疾病的關(guān)系[21]。而丙泊酚低、中、高劑量組大鼠甲狀腺組織PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)水平高于SD組，caspase-3蛋白表達(dá)水平低于SD組，且趨向于正常，表明丙泊酚可促進(jìn)PI3K/Akt通路激活，提示丙泊酚抑制SD大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡，改善甲狀腺激素分泌功能的作用，可能與激活PI3K/Akt通路有關(guān)。

綜上所述，丙泊酚可激活SD大鼠甲狀腺組織PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)，抑制甲狀腺細(xì)胞凋亡和損傷，改善機(jī)體激素分泌，這可能為闡明丙泊酚改善SD睡眠和緩解睡眠不足引起的甲狀腺功能損傷，提供一定參考，但睡眠不足引起甲狀腺損傷機(jī)制復(fù)雜，本研究未設(shè)置通路抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證，睡眠不足引起的機(jī)體功能異常的具體生物學(xué)機(jī)制仍需繼續(xù)研究。