SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合檢測在肺癌診斷中的應(yīng)用*

楊德平，張 萍，金慧敏，張 艷，鄭江花

上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，上海 201318

肺癌是人類病死率最高的腫瘤之一[1]。由于吸煙、空氣污染和社會人口老齡化等因素影響，中國肺癌的發(fā)病情況更加突出[2]。著名的英國腫瘤學(xué)家PETO教授曾預(yù)測，到2025年，中國將每年有高達100萬的新發(fā)肺癌患者[3]。據(jù)我國癌癥中心數(shù)據(jù)報道，每年有78萬新發(fā)肺癌病例,其中有70萬患者病死。據(jù)閔佩紅等[4]報道，我國75%的肺癌患者在就診時已屬晚期，5年生存率約16.1%。因此，尋找有效的早期篩查方法，是提高肺癌患者生存率及早期干預(yù)治療的關(guān)鍵[5]。目前，診斷肺癌最常用的是內(nèi)鏡檢查技術(shù)，這項技術(shù)特異度和靈敏度較高，但它是有創(chuàng)侵入性操作，例如支氣管鏡等，會給患者帶來額外痛苦[6]。鱗狀細胞癌相關(guān)抗原(SCC)、癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)等腫瘤標(biāo)志物也是臨床上常用的肺癌輔助診斷指標(biāo)，但研究表明單獨檢測這些腫瘤標(biāo)志物的靈敏度均低于60%[7]。隨著人們對表觀遺傳學(xué)DNA甲基化的認識，人們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化異常存在于許多人類惡性腫瘤中，在腫瘤形成的早期即發(fā)生，是許多腫瘤的里程碑事件[8-9]。有研究提示，SHOX2和PTGER4基因的高度甲基化能導(dǎo)致患者抑癌功能沉默，促進癌癥發(fā)生，其基因的甲基化在肺癌發(fā)生的早期即可出現(xiàn)，這2個基因甲基化檢測可對目前肺癌的常規(guī)診斷方法給予補充[10-11]。同時血漿中SHOX2和PTGER4基因甲基化情況可以提示肺結(jié)節(jié)患者病變的良惡性，減少患者不必要的有創(chuàng)檢查[11]。但關(guān)于血漿 SHOX2和PTGER4基因甲基化在肺癌診斷中的臨床研究仍較少。因此，本研究通過SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合檢測,探討這3項指標(biāo)輔助診斷肺癌的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入標(biāo)準：根據(jù)《2007中國肺癌臨床指南》和《中國肺部結(jié)節(jié)分類、診斷與治療指南(2016年版)》診斷為肺癌和肺部良性疾病的患者。選擇2019年1月至2020年5月在上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院就診、符合上述標(biāo)準的患者共104例，其中肺癌(肺癌組)48例，男26例、女22例，年齡33～92歲、平均(66.77±13.22)歲，肺鱗癌20例、小細胞肺癌(SCLC)6例、非鱗非小細胞肺癌 (NSCLC)22例；56例良性肺病患者(良性肺病組)中，男25例、女31例，年齡26～89歲、平均(61.25±15.32)歲。兩組患者性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。

1.2儀器與試劑 Cyfra21-1和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)采用新產(chǎn)業(yè)Maglumi 800全自動化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑進行檢測，SCC和CEA采用雅培I2000全自動免疫分析儀及配套試劑進行檢測。SHOX2和PTGER4基因甲基化采用美國ABI公司7500熒光定量PCR儀及北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供的人SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測試劑盒進行檢測。

1.3方法

1.3.1腫瘤標(biāo)志物檢測 用含促凝劑的真空采血管采集患者3 mL靜脈血，室溫靜置離心后上機。采用新產(chǎn)業(yè)Maglumi 800全自動化學(xué)發(fā)光分析儀和雅培I2000全自動免疫分析儀及配套試劑檢測血清中SCC、CEA、Cyfra21-1和NSE水平。檢測過程嚴格按照說明書操作。

1.3.2血漿SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測 用血漿游離DNA保存管采集患者10 mL靜脈血，緩慢顛倒10次，讓血液與管內(nèi)成分充分混勻，以3 000 r/min 離心10 min后，吸取上清液進行游離DNA提取，提取好的DNA在-20 ℃條件下保存待檢。采用美國ABI公司7500熒光定量PCR儀及北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司提供的人SHOX2和PTGER4基因甲基化檢測試劑盒檢測游離DNA中SHOX2和PTGER4基因甲基化情況。檢測過程嚴格按照說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化及部分腫瘤標(biāo)志物水平比較 兩組患者CEA、Cyfra21-1、NSE水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。肺癌組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化陽性率分別為66.7%(32/48)和39.6%(19/48)，明顯高于良性肺病組[25.0%(14/56)和5.4%(3/56)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.191、16.159，P<0.01)。肺癌組患者血清SCC水平高于良性肺病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.943，P<0.01)。見表1。

表1 兩組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化及部分腫瘤標(biāo)志物水平比較

2.2多因素Logistic回歸分析肺癌影響因素 以是否患有肺癌(賦值：否=0，是=1)為因變量，以SHOX2基因甲基化、PTGER4基因甲基化、SCC值為自變量進行多因素 Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，SHOX2、PTGER4基因甲基化及SCC是促使肺癌發(fā)生的影響因素(P<0.05)。見表2。

表2 SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC診斷肺癌Logistic回歸分析

2.3ROC曲線分析診斷肺癌的相關(guān)指標(biāo) 以SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC為檢驗變量，以是否患有肺癌為分類變量繪制 ROC曲線，結(jié)果顯示這3項指標(biāo)單獨檢測診斷肺癌的AUC最高為0.720，靈敏度最高為74.1%，特異度最高為94.6%。而當(dāng) SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合診斷肺癌時，AUC為0.826，靈敏度提高到77.8%，特異度為90.0%，相比這3項指標(biāo)單獨檢測，聯(lián)合檢測診斷肺癌的AUC和靈敏度都有所提高，尤其是聯(lián)合檢測的靈敏度從單項檢測的39.6%提高到77.8%。見表3和圖1。

表3 SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC診斷肺癌ROC曲線分析

圖1 不同指標(biāo)診斷肺癌的ROC曲線

2.4肺癌組不同病理類型患者血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化及血清SCC水平比較 肺癌組不同病理類型患者之間，血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化陽性情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；颊哐逯蠸CC水平在肺鱗癌與SCLC、非鱗NSCLC比較中，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，肺鱗癌患者血清SCC水平明顯高于其他病理類型的肺癌。而血清中SCC水平在SCLC與非鱗NSCLC比較中，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 肺癌組不同病理類型患者血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化及血清SCC水平比較

3 討 論

目前分子靶向治療和免疫抑制劑的應(yīng)用已明顯提高了晚期肺癌的生存率，但肺癌的病死率仍然很高。我國肺癌患者發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)已是晚期，因此，早期發(fā)現(xiàn)肺癌是提高患者生存率的關(guān)鍵。肺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種因素，其中以異常的DNA甲基化為主，整個基因組DNA的低甲基化和DNA啟動子區(qū)CpG島高甲基化在肺癌的發(fā)病機制中起著重要作用[12]。DNA甲基化伴隨著肺癌發(fā)展的全過程，故其有望成為肺癌診斷的分子標(biāo)志物[13]。 SHOX2是一種同源盒基因，其基因序列中有2個CpG島[14]。研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2基因在許多惡性腫瘤中，如腎癌、乳腺癌和肺癌等，都異常表達[15]。有研究顯示，對肺癌患者的癌細胞進行全基因組和多重甲基特異性甲基化實驗分析，SHOX2基因在大多數(shù)肺癌患者的癌組織中高度甲基化[15]，SHOX2基因甲基化可能是肺癌診斷的輔助指標(biāo)。PTGER4基因位于染色體5p13.1上，研究表明，敲除該基因或使用其拮抗劑可抑制NSCLC的生長，與SHOX2基因聯(lián)合檢測，可提高肺癌檢出率和診斷準確性[16]。

本研究在檢測SHOX2、PTGER4基因甲基化的同時也檢測臨床上一些肺癌常用的腫瘤標(biāo)志物，如SCC、CEA、Cyfra21-1和NSE。本研究結(jié)果顯示，肺癌組患者SHOX2、PTGER4基因甲基化陽性率分別為66.7%和39.6%，明顯高于良性肺病組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，此結(jié)果與夏冬平等[17]、初霞等[11]關(guān)于SHOX2、PTGER4基因甲基化診斷肺癌的研究結(jié)果具有較好的一致性。肺癌組患者的血清SCC水平高于良性肺病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示肺癌的發(fā)生與該指標(biāo)密切相關(guān)，有待進一步研究分析。而CEA、Cyfra21-1、NSE水平在肺癌組與良性肺病組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這與已有研究結(jié)果不相符[17]，可能與收集的標(biāo)本數(shù)量相對過少有關(guān)，筆者將加大標(biāo)本收集數(shù)量，做進一步研究。

本研究用多因素Logistic回歸對肺癌的影響因素進行了分析，結(jié)果顯示血漿SHOX2、PTGER4基因甲基化和血清SCC水平是肺癌的獨立影響因素(P<0.05)，提示這3項指標(biāo)在一定程度上可以獨立反映肺癌的情況。

為了分析SHOX2和PTGER4基因甲基化及SCC檢測對診斷肺癌的價值，本研究進行ROC曲線分析，結(jié)果顯示SHOX2基因甲基化檢測診斷肺癌的AUC為0.720，靈敏度為74.1%，特異度為70.0%；PTGER4基因甲基化檢測診斷肺癌的AUC為0.671，靈敏度只有39.6%，但特異度卻能達到94.6%；而血清SCC水平診斷肺癌的AUC能達到0.673，靈敏度為70.4%，特異度為55.0%。當(dāng)筆者將SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC 3項指標(biāo)進行聯(lián)合檢測，結(jié)果顯示，與單項指標(biāo)檢測相比，聯(lián)合檢測診斷肺癌的靈敏度從單項最低39.6%提高到77.8%，AUC達到0.826，總體診斷性能得到提高，這也提示這3項指標(biāo)的聯(lián)合檢測對鑒別診斷肺癌和肺部良性疾病具有較好的價值，可作為診斷肺癌的輔助指標(biāo)。

最后，本研究分析了SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC水平在肺癌組不同病理類型患者的情況，發(fā)現(xiàn)血漿中SHOX2、PTGER4基因甲基化在不同病理類型患者比較中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示SHOX2、PTGER4基因甲基化在不同病理類型的肺癌中無組織特異性，這與夏冬平等[17]的研究結(jié)果有所不同，可能與本研究收集的肺癌例數(shù)較少有關(guān)。而患者血清中SCC水平在肺鱗癌與SCLC和非鱗NSCLC比較中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與倪軍等[7]的研究結(jié)果一致，說明肺鱗癌患者血清中SCC水平明顯高于其他病理類型的肺癌。

綜上所述，SHOX2、PTGER4基因甲基化和SCC聯(lián)合檢測能提高肺癌診斷靈敏度和特異度，在診斷肺癌和肺部良性疾病方面具有較好的價值，可作為非侵入性診斷肺癌較好的輔助指標(biāo)。