MAR序列對逆轉錄病毒載體表達外源基因的調控作用

張 靖，張 婷，孫 強，朱 婷，石曉衛(wèi)

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院三全學院，新鄉(xiāng)453003）

基因治療是轉基因技術中比較熱門的研究內容，需要建立一個安全、高效的載體轉移系統(tǒng)［1?2］。最常用的轉移載體是逆轉錄病毒載體［3?4］。原因是重組病毒具有天然侵襲細胞、整合宿主細胞的能力，且基因組結構簡單，感染的效率以及特異性也優(yōu)于其他載體。但病毒的整合是隨機的［5］，外源基因表達可能會受到基因組干擾出現沉默問題［6?8］。有效提高逆轉錄病毒載體外源基因表達是一個急需解決的問題［9］。有文獻顯示MAR 序列參與轉錄調節(jié)［10?11］，在克服外源基因沉默［12?14］、提高轉基因表達效率［15］方面可以起到顯著作用。但是否能提高逆轉錄病毒載體表達效率還需進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、dNTP 等購自寶生物工程（大連）（TaKaRa）有限公司；CAT?ELISA 檢測試劑盒購自德國Roche Diagnostics Gmbh 公司。

1.2 方法

1.2.1 MAR序列擴增

根據GenBank 報道的人β?珠蛋白核基質結合區(qū)［16?17］（No：L22754）使用Primers 軟件設計如下引物：正向引物：5'?TTAGTAAGACATCACCTTGCATTT?3'；反向引物：5'?AGCCATAGTTTGAGTTACCCTTT?3'。改良降落PCR 程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，59 ℃～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，每個退火溫度4個循環(huán)，55 ℃又進行了30個循環(huán)。

1.2.2 載體構建

實驗中構建3 種載體。首先，構建中間載體pLXSN?CAT。將pLXSN 質粒、連接CAT 片段的vector用HpaⅠ/XhoⅠ酶切后連接、轉化、鑒定。其次，構建5'端含有MAR 序列的載體pLXSN5?CAT，連接MAR 片段的T?vector、pLXSN?CAT 質粒用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切后連接、轉化與鑒定。最后，構建3'端含有MAR 序列的載體pLXSN3?CAT，連接MAR 片段的T?vector、pLXSN?CAT 質粒用XhoⅠ/BamHⅠ酶切后連接、轉化與鑒定。

1.2.3 細胞轉染

細胞轉染實驗分為3 組進行，即pLXSN5?CAT 載體轉染組、pLXSN3?CAT載體轉染組和pLXSN?CAT載體轉染組。在24 孔板中以每孔1×105個細胞接種包裝細胞PA317，當孔中細胞到70%～80%融合時的陽離子聚合物法轉染3種載體［18］。

1.2.4 陽性克隆篩選

細胞轉染48 h 后傳代，用含200 mg/L G418 的DMEM 培養(yǎng)基篩選陽性細胞。以未轉染的細胞作為對照。根據細胞生長情況每天增加50～100 mg/L G418，當G418 總量加至400～500 mg/L 時不再增量［19］，隨后維持G418 濃度，2～3 d 更換1 次含G418 的新鮮培養(yǎng)基［20］。10 d 后陽性克隆出現，挑選10 個克隆，進一步擴大細胞培養(yǎng)，待培養(yǎng)的細胞接近完全融合后移取上清液，即含有病毒的培養(yǎng)液。

1.2.5 陽性克隆鑒定

提取陽性細胞基因組DNA，正常PA317 細胞基因組為對照，采用針對報告基因CAT序列設計引物，擴增片段為439 bp。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 個循環(huán)；最后72 ℃充分延伸5 min。反應結束后分別取5 μL反應產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.6 ELISA分析

陽性細胞篩選成功8～11 d 后進行病毒液的制備［21］。將3種載體形成的病毒上清液感染Bel?7404肝癌細胞，未感染病毒的Bel?7404 細胞作為對照組。用G418 進行陽性細胞篩選。待篩選出的陽性細胞密度達80%～90%后通過計數調整每組細胞為相同濃度，收集細胞后進行CAT酶表達量分析。

2 結果與討論

2.1 MAR擴增

提取外周血基因組DNA 為模板進行β?珠蛋白MAR 序列擴增，電泳結果如圖1 所示，PCR 產物與設計相符，序列為770 bp。將人β?珠蛋白MAR 序列的PCR 產物連接到pMD18?T 載體上，送到上海生工公司進行測序。測序結果通過Blast 比對顯示出人β?珠蛋白MAR與GenBank報道的MAR同源性高達99%。

圖1 β?珠蛋白MAR PCR擴增電泳圖Figure 1 Agarose electrophoresis of β?globin MAR PCR product

2.2 載體鑒定

圖2（a）顯示，載體經HpaⅠ/XhoⅠ酶切有660 bp的片段切出，經XhoⅠ單酶切顯示一條線狀DNA，酶切結果與載體構建相符，說明成功構建pLXSN?CAT。圖2（b）顯示，載體經EcoRⅠ/HpaⅠ酶切有1 300 bp 的片段切出，經EcoRⅠ單酶切顯示一條線狀DNA，酶切結果與載體構建相符，說明成功構建pLXSN5?CAT。圖2（c）顯示，載體經Bam HⅠ單酶切后顯示一條線狀DNA，經XhoⅠ/Bam HⅠ雙酶切后能切出1 300 bp 的片段，與預期片段大小相符。結合載體構建圖進行分析，表明已成功構建pLXSN3?CAT。

圖2 載體酶切電泳圖Figure 2 Agarose electrophoresis of vector by enzyme digestion

2.3 克隆篩選

載體轉染PA317 細胞，用含500 mg/mL G418 的培養(yǎng)基進行陽性細胞克隆篩選，加入G418 第2 天，對照組出現細胞形態(tài)異常的情況，實驗組不太明顯。第3天，實驗組出現細胞形態(tài)異常，對照組出現大量死亡的表型。第4天，實驗組出現大片死亡的表型［圖3（c）］，第6天，對照組細胞全部死亡［圖3（d）］，實驗組剩下零星細胞存活［圖3（e）］。第12 天，實驗組個別區(qū)域可見細胞分裂相，經過3 周培養(yǎng)，細胞逐漸形成抗性細胞克?。蹐D3（f）］?？寺⌒纬珊髮A317細胞轉移。

圖3 G418篩選后實驗組與對照組細胞形態(tài)Figure 3 The experimental group and the control group after G418 screening

2.4 克隆鑒定

提取轉染后的陽性細胞基因組DNA，以正常PA317 細胞基因組DNA 為對照組，采用針對報告基因CAT 序列設計引物，如圖4 所示，陽性細胞擴增出的片段為439 bp，而對照組無片段擴出，表明轉染后的陽性細胞含有正確的報告基因序列且抗性克隆的出現是抗性基因表達的結果。

圖4 報告基因PCR電泳圖Figure 4 Agarose electrophoresis of report gene PCR

2.5 ELISA分析

將不含MAR 的載體作為對照，將3 種表達載體形成的病毒上清液分別感染Bel?7404 細胞。收集細胞，進行CAT 酶表達量的分析。實驗組中3 種載體平均CAT 酶含量如表1 所示，3'端含MAR 的載體轉染的細胞平均CAT酶含量最高，比不含MAR 的質粒轉染的細胞平均提高11倍（P=0.02，t=4.432），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而5'端含MAR的載體轉染的細胞CAT酶含量與不含MAR 的質粒轉染的細胞CAT 酶含量水平相當（P = 0.957，t =0.111），差異沒有統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），見表2。

表1 實驗組中平均CAT酶含量（A405）Table 1 The average concentration of cat enzyme in experimental group

表2 報告基因在實驗組中含量檢測統(tǒng)計學分析Table 2 Statistics analysis of cat enzyme concentration in experimental group ng/mL

注：pLXSN5?CAT載體組與對照組pLXSN?CAT相比較，*P=0.957，t=0.111，*P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義；pLXSN3?CAT 載體組與對照組pLXSN?CAT 相比較，**P=0.02，t=4.432，**P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義

3 結論

本研究將核基質結合區(qū)分別整合到逆轉錄病毒載體不同位置上，以研究MAR 對逆轉錄病毒載體在轉基因方面的調控作用。結果表明，與未插入MAR 序列的載體相比，3'端含MAR 序列的載體可使CAT 報告基因的表達水平平均提高11倍，而5'端含MAR序列的載體則與未插入MAR 序列的載體的CAT 報告基因表達水平相當，表明將核基質結合區(qū)整合到逆轉錄病毒載體上的確可以明顯提高目的基因的表達，但核基質結合區(qū)的調控作用有明顯的位置效應。