超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖工藝優(yōu)化

郝慧敏，縱偉

（1.鶴壁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鶴壁 458030；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

黑木耳（Auricularia auricular）又稱云耳、木菌，屬真菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、木耳科、木耳屬，性平、味甘，是著名的藥食兩用真菌[1]，素有“菌中之冠”之稱。黑木耳多糖是黑木耳中含有的一種生物活性成分，研究表明其具有抑制腫瘤[2]、調(diào)節(jié)免疫力[3-4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、調(diào)節(jié)血糖[7]、延緩衰老[8]、抗突變[9]、抗炎[10]、抗菌[11]等功效，在食品和保健醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

目前，黑木耳多糖提取方法有熱水浸提法、稀堿浸提法、酶法、微波輔助法、超聲波輔助法和超微粉碎法等[12-17]，傳統(tǒng)的提取方法存在著提取率低、提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗大等缺點(diǎn)[18]。半仿生提取法（semi-bionic extraction，SBE）是一種新的提取技術(shù)，它是基于“灰思維”方式，模擬人體胃腸環(huán)境，在一定的酸、堿度溶液中依次連續(xù)提取，從生物藥劑學(xué)角度，以模擬給藥的方式建立的一種提取技術(shù)[19-22]。超聲波輔助提取是利用超聲的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)等作用，加速提取的進(jìn)行[23]。目前超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以黑木耳為主要原料，采用超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；葡萄糖、檸檬酸、鹽酸、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、硫酸、苯酚（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；BAS124S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TDL-50B臺(tái)式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；HH-M4電熱恒溫水浴鍋：上海赫田科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；JY92-ⅡDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖

根據(jù)半仿生法的原理，在模擬人體胃腸道環(huán)境的pH值分別為1.4、7.5和8.3的條件下，準(zhǔn)確稱取經(jīng)烘干、粉碎后的黑木耳粉樣品10 g，分別在上述pH值的溶液中，協(xié)同超聲波法（一定的料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度）各提取1次，3次提取液合并后在5 000 r/min條件下離心10 min，然后將上清液減壓濃縮，濃縮液加3倍體積95%的乙醇后，在4℃冰箱中靜置24 h，然后在5 000 r/min條件下離心10 min，沉淀物經(jīng)真空干燥得到黑木耳粗多糖。

1.3.2 黑木耳多糖的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[24]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 黑木耳多糖提取率的計(jì)算

黑木耳多糖提取率根據(jù)下列公式計(jì)算[25-26]。

式中：c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為定容體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為黑木耳干粉質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取10 g黑木耳粉5份，在模擬人體胃腸道環(huán)境的pH值分別為1.4、7.5、8.3的條件下，按1.3.1的方法進(jìn)行超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖，考察不同因素對(duì)黑木耳多糖提取率的影響。在固定其中3個(gè)因素水平的條件下，對(duì)余下1個(gè)因素設(shè)計(jì)5個(gè)不同水平的試驗(yàn)，固定條件為：料液比 1∶30（g/mL），超聲功率400 W，超聲溫度60℃，超聲時(shí)間50 min。分別選取料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），超聲功率 100、200、300、400、500 W，超聲溫度30、40、50、60、70 ℃，超聲時(shí)間 30、40、50、60、70 min 進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取表1中所列的4個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)黑木耳多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor levels of orthogonal experimental design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Office進(jìn)行作圖，正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1專業(yè)版進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和方差分析。

(5)基準(zhǔn)指代,此類指代與前4類是不同的,也是面向事件的指代與傳統(tǒng)指代的不同點(diǎn),前4類中存在指代的兩個(gè)要素都是指向同一實(shí)體,而此類指代并非指向同一實(shí)體,而是以先行要素為基準(zhǔn),來(lái)確定照應(yīng)要素的具體位置,例如“香溪洞景區(qū)”←“附近山體”.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)研究

2.1.1 料液比對(duì)提取率的影響

料液比對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ration on the extraction rate

由圖1可知，黑木耳多糖提取率隨著溶劑量的增加逐漸升高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL），再繼續(xù)增大溶劑的量，多糖提取率變化趨緩。這可能是因?yàn)?，增加溶劑的量，黑木耳?xì)胞內(nèi)外的濃度差增大，傳質(zhì)速率就會(huì)加快，提取率升高；但當(dāng)溶劑達(dá)到一定量時(shí)，溶質(zhì)溶出基本完全，再繼續(xù)增加用量，提取率也不再明顯升高而是趨于穩(wěn)定。故取料液比1∶30（g/mL）為佳。

2.1.2 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響

超聲功率對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rate

由圖2可知，多糖提取率隨著超聲功率的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在超聲功率400 W時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大，再繼續(xù)增加超聲功率，提取率反而降低。這可能是因?yàn)?，增加超聲功率，促使超聲波的超聲和機(jī)械效應(yīng)增強(qiáng)，超聲波對(duì)黑木耳細(xì)胞破壁程度增強(qiáng)，多糖溶出增多，提取率升高；當(dāng)超聲功率大于400 W后，超聲波在其聲源附近，會(huì)產(chǎn)生大量的空化氣泡，形成空化屏蔽的環(huán)境，導(dǎo)致空化泡不能充分崩解，提取率降低。故取超聲功率400 W為佳。

超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate

由圖3可知，多糖提取率隨著超聲溫度的升高呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在超聲溫度為60℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高，再繼續(xù)提高超聲溫度，提取率反而降低。這可能是因?yàn)?，增加超聲溫度，溶劑擴(kuò)散速度加快，多糖溶出增多，提取率升高，當(dāng)溫度大于60℃后，再繼續(xù)升高溫度，多糖會(huì)發(fā)生降解，提取率降低。故取超聲溫度60℃為佳。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate

由圖4可知，多糖提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到40 min后，再繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，多糖提取率也不會(huì)明顯升高而是趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)?，增加超聲時(shí)間，黑木耳細(xì)胞破碎程度和數(shù)量增加，多糖溶出增多，提取率升高，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)40 min后，多糖已溶出完全，不會(huì)再明顯變化。故取超聲時(shí)間40 min為佳。

2.2 超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖的工藝正交優(yōu)化研究

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experimental design

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The variance analysis results

由表2、表3的數(shù)據(jù)分析可知，4個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋篈＞C＞B＞D，得出最優(yōu)組合為 A2B3C2D3。料液比和超聲溫度對(duì)黑木耳多糖提取率的影響達(dá)到了顯著水平，其它不顯著。通過(guò)R值分析，超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工藝參數(shù)為：A2B3C2D3。該最優(yōu)組合與正交試驗(yàn)表2中的較優(yōu)組合A2B2C3D1不一致，故需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4 The result of orthogonal experimental verifies

由表4可知，最終超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖的最佳工藝組合為：A2B3C2D3，即料液比 1∶30（g/mL），提取溫度60℃，超聲功率500 W，超聲時(shí)間60 min。在此最優(yōu)組合條件下，得到黑木耳多糖提取率為22.52%（3次平均值）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波協(xié)同半仿生法提取黑木耳多糖，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化，最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶30（g/mL），提取溫度60℃，超聲功率500 W，超聲時(shí)間60 min，在此條件下，黑木耳多糖提取率為22.52%，本試驗(yàn)為黑木耳多糖的提取提供一種新的方法。