辣木葉黃酮對(duì)緩解小鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的影響

（天津師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

辣木（Moringa oleifera）是辣木科辣木屬熱帶落葉喬木，起源自印度西北部，目前在我國(guó)云南、廣西、廣東等地區(qū)均有種植[1]。辣木中含有豐富的碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉中含有類胡蘿卜素、抗壞血酸、黃酮類、多酚類、多糖類和生物堿等多種生物活性物質(zhì)，其中主要活性物質(zhì)黃酮對(duì)機(jī)體具有調(diào)節(jié)代謝、抗氧化、殺菌抗炎、改善免疫力等作用[3]。

運(yùn)動(dòng)員由于長(zhǎng)期高強(qiáng)度訓(xùn)練和比賽，容易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性疲勞的癥狀[4]。運(yùn)動(dòng)性疲勞是訓(xùn)練和比賽負(fù)荷超過(guò)了機(jī)體承受的能力，而產(chǎn)生的暫時(shí)的生理機(jī)能減退現(xiàn)象，是訓(xùn)練的生理反應(yīng)，也是人體的自我保護(hù)機(jī)制[5]。但如果人體長(zhǎng)期處于疲勞狀態(tài)，前一次運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的疲勞還未及時(shí)消除，新的疲勞又產(chǎn)生，疲勞就會(huì)積累，久之產(chǎn)生過(guò)度疲勞，導(dǎo)致機(jī)體尿素氮、睪酮、皮質(zhì)酮、乳酸、乳酸脫氫酶、肌酸激酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛等生化指標(biāo)異常，引起暫時(shí)性的生理機(jī)能減退，影響運(yùn)動(dòng)成績(jī)，嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)性疲勞可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)員運(yùn)動(dòng)能力急劇下降，危及運(yùn)動(dòng)員的身體健康[6]。因此，及時(shí)消除運(yùn)動(dòng)性疲勞，提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力，對(duì)于運(yùn)動(dòng)員至關(guān)重要[7]。辣木葉營(yíng)養(yǎng)豐富，具有抗氧化、抗疲勞、抗菌等功效[8]。2012年我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)辣木為新資源食品，可用于功能食品研發(fā)[9]。鑒于辣木葉黃酮類物質(zhì)具有極強(qiáng)的抗氧化能力，本研究采用小鼠過(guò)度訓(xùn)練模型，研究辣木葉黃酮對(duì)過(guò)度訓(xùn)練小鼠緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的功效。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)健康雄性BALB/c小鼠：50只，4周齡，體重18 g～20 g，許可證號(hào) SCXK（京）2019-0003，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；辣木葉：云南天佑科技開發(fā)有限公司；紅景天西洋參膠囊：廣州賽健生物科技有限公司；血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、睪酮（testosterone，TTS）、皮質(zhì)酮（corticosterone，CTC）、血乳酸（blood lactic acid，BLA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、蒽酮等試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

ZH-PT型動(dòng)物跑臺(tái)：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；TGL-20B高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；AL204電子天平：上海梅特勒托利多儀器有限公司；FSH-2型勻漿機(jī)：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；ALPHA 1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Christ公司；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；iMagic-M7全自動(dòng)生化分析儀：深圳市庫(kù)貝爾生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉黃酮的制備

1）辣木葉去脂：將40 g辣木葉粉碎成粉末置于索氏提取器萃取管中，在燒瓶中加入400 mL石油醚設(shè)置溫度恒定70℃，經(jīng)8 h冷凝回流后，30℃干燥30 min，即為去脂辣木葉粉末[10]。

2）提取辣木葉黃酮：將去脂辣木葉粉末按照料液比 1∶50（g/mL）加入 70%乙醇溶液中，超聲（200 W）輔助提取30 min，60℃下浸提90 min，然后8 000 r/min離心10 min，抽濾得到辣木葉黃酮上清液[10]。

3）分離純化辣木葉黃酮：取辣木葉黃酮上清液10 mL用HPD-750樹脂吸附2h，然后用20mL蒸餾水和30mL 70%乙醇依次洗脫樹脂表面黃酮，再用乙酸乙酯萃取純化，經(jīng)測(cè)定黃酮含量為71.6%，通過(guò)反相高效液相色譜法測(cè)定其成分，異槲皮苷41.27%，槲皮素21.76%[10]。

將制備樣品與蒸餾水按照一定比例混合，得到質(zhì)量濃度為10、20、40 mg/mL的灌胃液，備用。

1.3.2 動(dòng)物分組、模型制備及運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案

試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)條件：溫度20℃～22℃，相對(duì)濕度50%～55%，自然光照，自由飲水。小鼠普通飼料飼養(yǎng)一周，隨機(jī)分為5個(gè)試驗(yàn)組，分別為模型組（MG組）、對(duì)照組（RG組）和辣木葉黃酮低（FMLL組）、中（FMLM組）、高劑量組（FMLH組），每組10只小鼠，共50只。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案：實(shí)驗(yàn)小鼠先進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練1周，跑臺(tái)坡度10°，跑速10 m/min，持續(xù)30 min。之后正式訓(xùn)練8周，每周訓(xùn)練6 d，休息1 d，跑臺(tái)坡度10°，跑速?gòu)?0 m/min開始，每分鐘速率增加1 m/min，直至增加到40 m/min結(jié)束。訓(xùn)練期間觀察并記錄實(shí)驗(yàn)小鼠的一般表現(xiàn)（精神狀態(tài)、攝食量、睡眠、死亡率）及訓(xùn)練狀況（動(dòng)作協(xié)調(diào)性、跑步速度、是否疲勞、是否俯臥位、是否垂頭等）。

模型組（MG組）：每日定時(shí)灌胃1次蒸餾水100 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案進(jìn)行訓(xùn)練。

對(duì)照組（RG組）：將紅景天西洋參膠囊與蒸餾水配制成濃度為20 mg/mL的溶液，每日定時(shí)灌胃1次，灌胃劑量10 mL/（kg·d），折算劑量為200 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案進(jìn)行訓(xùn)練。

辣木葉黃酮低（FMLL組）、中（FMLM組）、高劑量組（FMLH組）：補(bǔ)充辣木葉黃酮溶液，濃度分別為10、20、40 mg/mL，每日定時(shí)灌胃 1 次，灌胃劑量10 mL/（kg·d），折算劑量為100、200、400 mg/（kg·d），灌胃后1 h小鼠按照運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案進(jìn)行訓(xùn)練。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量測(cè)定

試驗(yàn)第1天和第56天定時(shí)（8：00）稱量小鼠體質(zhì)量并記錄。

1.3.4 生化指標(biāo)測(cè)定

小鼠末次運(yùn)動(dòng)后，眼球取血，血液樣品以3000r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存；小鼠脫頸處死，取其肝臟和雙側(cè)后腿肌肉制備組織勻漿，分別剪取肝組織或肌組織放入燒杯中，用0.9%生理鹽水漂洗3遍，洗去血液，用濾紙擦干并稱取1 g，加入9 g生理鹽水，置于冷凍研磨機(jī)中粉碎勻漿，將制備的勻漿3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存。血清、肝臟和肌肉組織嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清尿素氮（BUN）、睪酮（TTS）、皮質(zhì)酮（CTC）、血乳酸（BLA）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、肌糖原、肝糖原等含量或活力指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

檢測(cè)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)期間小鼠的一般表現(xiàn)

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，辣木葉黃酮高劑量組和對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)、睡眠、食欲均良好。模型組小鼠及辣木葉黃酮低、中劑量組小鼠在第2周以后出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、嗜睡現(xiàn)象。第4周時(shí)，辣木葉黃酮低、中劑量組小鼠精神狀態(tài)恢復(fù)，睡眠良好，較為活潑。

2.2 辣木葉黃酮對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

實(shí)驗(yàn)期間辣木葉黃酮對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響如圖1所示。

圖1 辣木葉黃酮對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n=10）Fig.1 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on body weight of mice（n=10）

由圖1可知，實(shí)驗(yàn)初期各組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著差異，8周運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，各組小鼠體質(zhì)量均增加，與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對(duì)照組小鼠體質(zhì)量均顯著升高（P＜0.05）。模型組小鼠由于未使用任何營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，疲勞程度較重，食欲不振，體質(zhì)量也低于辣木葉各劑量組。

2.3 辣木葉黃酮對(duì)小鼠血清抗疲勞指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)期間辣木葉黃酮對(duì)小鼠血清抗疲勞指標(biāo)的影響如圖2所示。

圖2 辣木葉黃酮對(duì)小鼠血清抗疲勞指標(biāo)的影響（n=10）Fig.2 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the anti-fatigue levels of serum in mice（n=10）

由圖2可知，模型組小鼠血清睪酮含量顯著低于其它各組、皮質(zhì)酮含量顯著高于其它各組，表明該組疲勞程度較重。與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對(duì)照組小鼠血清中睪酮含量分別升高11.0%、21.7%、26.6%、23.3%（P＜0.05），皮質(zhì)酮含量各組分別降低 9.1%、15.8%、20.6%、18.3%（P＜0.05）。與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對(duì)照組小鼠血清尿素氮含量各組分別降低12.7%、21.1%、25.6%、21.8%（P＜0.05），當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，糖和脂肪供能不能滿足機(jī)體需求，蛋白質(zhì)分解代謝水平加快，尿素氮是人體蛋白質(zhì)代謝主要終產(chǎn)物，在肝臟中合成，血清中的尿素氮濃度隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增加而增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠的血清尿素氮濃度顯著低于模型組，表明辣木葉黃酮能有效減少運(yùn)動(dòng)中蛋白質(zhì)的分解，延緩尿素氮的合成，提高機(jī)體對(duì)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力[12]。與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對(duì)照組小鼠血乳酸含量分別降低12.5%、20.1%、22.2%、20.4%（P＜0.05），乳酸脫氫酶活力各組分別降低 12.6%、17.8%、20.5%、19.7%（P＜0.05），肌酸激酶活力各組分別降低18.7%、30.3%、38.1%、34.2%（P＜0.05）。在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中，機(jī)體以無(wú)氧酵解為主要供能方式，葡萄糖經(jīng)過(guò)無(wú)氧酵解代謝后生成乳酸，隨運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加，血液及肌細(xì)胞中乳酸也隨之增加，乳酸脫氫酶可催化丙酸與L-乳酸之間的反應(yīng)，其活力反映機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力，肌酸激酶在肌細(xì)胞中參與細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)、三磷酸腺苷合成、肌肉收縮，運(yùn)動(dòng)后可導(dǎo)致其活性明顯升高[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠的血清中乳酸含量、肌酸激酶和乳酸脫氫酶活力顯著低于模型組，表明辣木葉黃酮可以有效清除高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中機(jī)體無(wú)氧代謝產(chǎn)生的乳酸，降低肌酸激酶和乳酸脫氫酶活性，避免代謝產(chǎn)物堆積對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的傷害，提高機(jī)體對(duì)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力及抗疲勞能力[14]。與對(duì)照組比較，辣木葉黃酮中、高劑量組血清中睪酮含量、皮質(zhì)酮含量、乳酸含量、尿素氮含量、乳酸脫氫酶活力和肌酸激酶活力沒(méi)有顯著差異，表明辣木葉黃酮改善運(yùn)動(dòng)性疲勞的效果與功效明確的抗疲勞物質(zhì)功效類似[15]。

2.4 辣木葉黃酮對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備量的影響

實(shí)驗(yàn)期間辣木葉黃酮對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備量的影響如圖3所示。

圖3 辣木葉黃酮對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備量的影響（n=10）Fig.3 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the reserve of hepatic glycogen and muscle glycogen in mice（n=10）

由圖3可知，與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對(duì)照組小鼠運(yùn)動(dòng)后體內(nèi)肝糖原儲(chǔ)備量和肌糖原儲(chǔ)備量均有顯著升高（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，辣木葉黃酮低劑量組肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備量分別降低34.5%和 24.4%（P＜0.05），辣木葉黃酮中、高劑量組沒(méi)有顯著差異。長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)，機(jī)體能源物質(zhì)消耗、代謝物質(zhì)積累，是運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的重要原因[16]。在運(yùn)動(dòng)中葡萄糖為機(jī)體提供大量能量，供能的葡萄糖主要源自肝糖原和肌糖原分解。隨著運(yùn)動(dòng)耗能的持續(xù)，糖原儲(chǔ)備量也隨之減少，增加糖原的儲(chǔ)備量、節(jié)省糖原的利用，可以有效地提高機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠的肝糖原和肌糖原儲(chǔ)備量顯著高于模型組，表明辣木葉黃酮具有增加糖原儲(chǔ)備量、減少運(yùn)動(dòng)中能源消耗的作用，從而提高運(yùn)動(dòng)耐力，改善運(yùn)動(dòng)性疲勞的程度[18]。

2.5 辣木葉黃酮對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響

實(shí)驗(yàn)期間辣木葉黃酮對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠血清和肝組織抗氧化效果的影響如圖4所示。

圖4 辣木葉黃酮對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞小鼠抗氧化效果的影響（n=10）Fig.4 Effects of flavonoids from Moringa oleifera leaves on the antioxidation of serum and hepatic tissue in mice（n=10）

由圖4可知，與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對(duì)照組小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中丙二醛含量分別降低 13.1%、20.1%、23.4%、23.0%（P＜0.05），肝組織中丙二醛含量分別降低18.1%、21.3%、29.2%、30.6%（P＜0.05），機(jī)體高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生自由基，自由基催化生物膜中的多不飽和脂肪酸產(chǎn)生丙二醛等脂質(zhì)過(guò)氧化物[19]。通過(guò)機(jī)體內(nèi)丙二醛含量評(píng)價(jià)其脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞損傷程度，是反映機(jī)體氧化損傷的重要指標(biāo)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠血清、肝臟中丙二醛含量顯著低于模型組，表明辣木葉黃酮可有效減弱過(guò)度訓(xùn)練中細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，減少丙二醛的生成，維持抗氧化系統(tǒng)的正常功能，緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生[21]。

與模型組比較，辣木葉黃酮低、中、高劑量組、對(duì)照組小鼠運(yùn)動(dòng)后血清和肝組織中過(guò)氧化氫酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力均顯著升高（P＜0.05），尤其是高劑量組，血清和肝組織中過(guò)氧化氫酶活力分別提高46.8%和20.4%，超氧化物歧化酶活力分別提高43.6%和19.2%，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力分別提高31.2%和23.6%，隨著辣木葉黃酮攝入劑量的增加，抗氧化酶活力的提高也越明顯。與對(duì)照組比較，辣木葉黃酮中、高劑量組血清和肝組織中丙二醛含量、過(guò)氧化氫酶活力、超氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力沒(méi)有顯著差異。高強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，機(jī)體能量快速消耗，代謝產(chǎn)物大量積累，骨骼肌中氧自由基和其它活性氧/氮物質(zhì)增加、抗氧化酶系不斷減少，高濃度活性氧可引起脂類、蛋白質(zhì)、核酸以及細(xì)胞活性成分等發(fā)生功能性氧化損傷，促使細(xì)胞凋亡及抗氧化系統(tǒng)平衡作用失調(diào)，從而引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞[22]。為維持機(jī)體抗氧化系統(tǒng)平衡，提高抗氧化酶活力是關(guān)鍵[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉黃酮低、中、高劑量組小鼠血清、肝組織中過(guò)氧化氫酶活力、超氧化物歧化酶活力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力均顯著高于模型組，表明辣木葉黃酮可有效增強(qiáng)抗氧化酶的活力，提高抗氧化能力，加速清除自由基和活性氧，改善機(jī)體抗疲勞的能力[24]。

3 結(jié)論

綜上所述，辣木葉黃酮可以有效提高機(jī)體肝糖原和肌糖原的儲(chǔ)備量、增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等抗氧化酶系的活力，加速血清尿素氮、丙二醛等代謝物質(zhì)的清除，減少其在體內(nèi)積累，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整，抵抗和延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞的產(chǎn)生[25]。本研究為辣木葉黃酮的開發(fā)利用提供參考。