大果山楂酒發(fā)酵過程中抗氧化活性和香氣成分分析

鐘平娟，葉麗芳，門戈陽，鄧澤元*，鐘瑞敏，*，藍鑫

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.韶關學院，廣東 韶關 512005；3.廣東廣三農(nóng)生物科技有限公司，廣東 韶關 512528)

大果山楂又名廣山楂、澀梨，為薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物，主要分布在我國廣西、廣東、福建等南方地區(qū)。成熟時呈黃色或黃綠色，與北方盛產(chǎn)的紅山楂外觀上有明顯區(qū)別[1-2]。大果山楂富含酚酸、多酚、黃酮和多糖等功能成分，并具有抗氧化、抑菌、降壓、降脂、保肝、抗腫瘤和加強心肌收縮力等多種生物活性[2-7]。大果山楂每公頃產(chǎn)量可達30噸以上，但肉質(zhì)硬實、酸而澀，不太適宜鮮吃。隨著對大果山楂的藥理和經(jīng)濟價值的深入研究，廣西、廣東等地區(qū)的栽培面積不斷擴大，面臨大規(guī)模深加工的需求。

傳統(tǒng)的大果山楂加工方式主要是通過腌制、干燥等工藝制備果脯、果干等，其它類型加工方式的報道很少[8-10]。根據(jù)大果山楂果肉特性和化學成分特點，為保留生物活性成分和豐富的原果風味，前期研究了大果山楂酒發(fā)酵的優(yōu)化工藝，結果表明，通過液體深層發(fā)酵生產(chǎn)果酒可有效釋放大果山楂果肉組織的生物活性成分，并形成類似于香檳的清爽酒香。鑒于還沒有文獻對大果山楂酒的活性成分和抗氧化活性以及香氣成分進行報道。在此基礎上，本試驗擬采用頂空固相微萃取（head-space solid-phase micro extraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用對不同發(fā)酵時段的樣品香氣成分進行提取與分析，并對不同發(fā)酵時段的樣品的總酚含量以及抗氧化性進行研究，旨在為開發(fā)優(yōu)質(zhì)大果山楂酒高值化途徑提供更為科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂鮮果：韶關銳新達農(nóng)業(yè)科技有限公司。葡萄酒高活性干酵母（BV818型）：湖北安琪酵母股份有限公司；果膠酶（30 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；福林酚試劑（分析純）：上海荔達生物科技有限公司；沒食子酸一水合物（分析標準品）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗壞血酸（純度≥98.0%）：上海吉如生物科技有限公司；DPPH：東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設備

振蕩培養(yǎng)箱（SPX-250B-D）：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；30 L全自動發(fā)酵系統(tǒng)（Bwg-6030型）：匯和堂生物工程設備（上海）有限公司；雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901）：北京普析通用儀器有限公司；數(shù)顯集熱式磁力攪拌器（DF101B）：金壇大地自動化儀器廠；氣質(zhì)聯(lián)用儀（QP-2010型）：日本島津公司；膠體磨（E2-100 L-2）：上海德東電機廠；數(shù)顯糖度計（PAL-1）：ATAGO（愛拓）中國分公司；平板密閉離心機（PSB800）：張家港市遠華機械制造廠；立式硅藻土過濾機（LY-400-20）：上海濾盈設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低溫發(fā)酵制備大果山楂酒

采用前期優(yōu)化的工藝進行果酒制備。選取成熟度高、無病害果，于90℃熱水中熱燙5 min，冷卻后添加果重等量的水再經(jīng)膠體磨打成細漿。于48℃恒溫果膠酶酶解2 h，調(diào)整糖度至22°Bx，升溫85℃滅菌15 min，冷卻后加入偏亞硫酸鉀。接種0.45%安琪低溫釀酒酵母于24℃進行恒溫酒精發(fā)酵，將酵母接入大果山楂發(fā)酵醪的時間記作0 h，第0 h即為大果山楂原漿，此時不含酒精，設置大果山楂酒樣品采集時間分別為6、24 h，以后每隔12 h取一次樣。直至殘?zhí)呛康陀? g/L時結束發(fā)酵。發(fā)酵液離心去渣，硅藻土過濾機精濾得到澄清的淡黃色大果山楂原酒。

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 理化分析

1）酒精度：酒精計法。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

2）總酸含量：指示劑法。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

3）殘?zhí)呛浚褐苯拥味ǚ╗11]。

4）總酚含量：Folin-Ciocalteu比色法，以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標，765 nm處的吸光值為縱坐標[12]，得到回歸方程為 y=0.0106x+0.025 7，R2=0.996 3。

5）DPPH自由基清除能力測定：以VC標準溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，對 DPPH·清除率為縱坐標[13]，得到回歸方程為 y=0.380 1x+2.348 9，R2=0.996 3，本試驗測定DPPH·清除能力用VC當量（VCEAC）來評價不同發(fā)酵階段大果山楂果酒的抗氧化能力。

6）ABTS+·清除能力測定：以VC標準溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，對ABTS+·清除率為縱坐標[14]，得到回歸方程為y=0.623 6x+0.659 8，R2=0.999 3，本試驗測定ABTS+·清除能力用VC當量（VCEAC）來評價不同發(fā)酵階段大果山楂果酒的抗氧化能力。

1.3.2.2 果酒芳香成分GC/MS測定

1）香氣成分的提取

取5 mL樣品溶液置于20 mL頂空瓶中，加入1 g氯化鈉，再加入叔丁醇20 μL做為內(nèi)標進行定量檢測，加蓋密封搖勻，于50℃水浴中平衡15 min，然后將老化好的 50/30 μm，DVB/CAR/PDMS針頭插入樣品瓶中，推出纖維頭，保持在45℃恒溫頂空吸附40 min，然后取出插入到GC-MS進樣口進行揮發(fā)性成分分離鑒定。

2）色譜條件

HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：柱箱溫度初始40℃保持2 min，以5℃/min升至80℃，再以3℃/min升到120℃，最后以10℃/min升至250℃，保持5 min；載氣為高純氦氣（99.999%），分流比為10∶1。進樣口溫度：250℃，載氣：He，壓力48.95kPa；分流比為 10∶1，流速 1 mL/min。質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250℃，EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描方式SCAN，質(zhì)量掃描范圍30 amu～550 amu，標準質(zhì)譜譜庫 NTST05。

各色譜峰對應的質(zhì)譜圖經(jīng)聯(lián)用儀的計算機譜庫NIST 05.L檢索并與標準譜圖對照，并結合已有的報道進行定性分析。

1.3.2.3 數(shù)據(jù)處理

利用IBM SPSS Statistics 22進行數(shù)據(jù)分析，3組及以上數(shù)據(jù)的組間顯著性差異采用單因素方差分析、最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）進行顯著性分析，數(shù)據(jù)采用（±SD）表示，p＜0.05 為差異顯著。用Pearson雙側檢驗法對總酚含量、DPPH自由基清除能力以及ABTS+·清除能力進行相關性分析，p＜0.05表示有顯著相關性。

2 結果與分析

2.1 大果山楂酒發(fā)酵過程中酒精度的變化

大果山楂鮮果經(jīng)熱燙鈍酶護色、破果和酶解液化后接種經(jīng)活化的釀酒酵母進行液態(tài)深層發(fā)酵，發(fā)酵過程中酒精度變化情況如圖1所示。

圖1 大果山楂酒釀造過程中酒精度變化Fig.1 Dynamic changes in the alcohol content of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine during brewing

發(fā)酵第1天分別在6 h和24 h取樣，平均酒精度分別達到（3.1±0.10）%vol和（7.9±0.06）%vol。此后每隔12 h取樣跟蹤酒精度變化，酒精度持續(xù)升高，72 h時達到峰值（12.7±0.10）%vol，96 h后測得殘?zhí)堑陀? g/L，酒精度為（12.1±0.06）%vol。造成以上酒精度變化的原因可能是發(fā)酵初期，酵母代謝旺盛，所需營養(yǎng)物質(zhì)充足，可用于自身生長繁殖與酒精發(fā)酵，使得酒精度迅速上升，隨著酒精度的升高，糖類物質(zhì)被消耗，酒精度變化趨于平穩(wěn)。與許多水果的果酒釀造周期7 d～15 d相比，大果山楂酒能在24℃發(fā)酵溫度下第1天酒精度就達到（7.9±0.06）%vol，并在72 h時酒精度達到最大，96 h結束整個干型果酒的發(fā)酵過程，其發(fā)酵速度是非?？斓?。一方面說明這種商用釀酒酵母活力較強，接種量適宜，同時也說明大果山楂果漿含有較全面的營養(yǎng)成分能夠很好地滿足釀酒酵母持續(xù)酒精發(fā)酵的代謝需求。對于果酒液態(tài)深層發(fā)酵，縮短發(fā)酵周期意味生產(chǎn)效率較高，也有利于減少因發(fā)酵蒸騰作用對原果香味造成的損失，這在果酒的實際生產(chǎn)過程中非常重要[15]。

2.2 大果山楂酒發(fā)酵過程中總酚的變化

果酒的酚類物質(zhì)具有抗氧化和抗誘導有機體突變等作用，同時可賦予果酒醇厚、豐滿、結構感強，后味悠長的特點[16]，可提高酒的耐儲存能力。大果山楂果發(fā)酵過程總酚的變化如圖2所示。

圖2 大果山楂酒發(fā)酵過程總酚的變化Fig.2 Dynamic changes of total phenols during the brewing period of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine

由圖2可知，發(fā)酵前大果山楂原漿的總酚含量為（1.53±0.02）GAE mg/mL，隨著發(fā)酵的進行，總酚含量有所降低，但在整個發(fā)酵過程中總酚含量基本保持較小的變化幅度，發(fā)酵結束時總酚含量為（1.24±0.03）GAEmg/mL。大果山楂酒在整個發(fā)酵過程中總酚含量相對平穩(wěn)，保留率均超過80%，而對比其他果酒發(fā)酵過程中總酚含量的變化，哈之才[17]發(fā)現(xiàn)寒富蘋果酒發(fā)酵過程中總酚含量保留率僅為40%左右，且呈波動減少趨勢。胡冀太[18]發(fā)現(xiàn)山楂酒發(fā)酵過程中總酚含量呈上升趨勢，而李楠等[19]發(fā)現(xiàn)山楂酒發(fā)酵過程中總酚含量幾乎保持平穩(wěn)?？梢姽瓢l(fā)酵過程中對總酚含量變化的研究結果并不一致，這可能與水果自身特性、發(fā)酵工藝條件（如浸漬工藝、發(fā)酵溫度、時間）等有關。本試驗中大果山楂汁帶渣發(fā)酵，在發(fā)酵6 h開始檢測到總酚含量有所降低，其原因可能是大果山楂經(jīng)磨漿、酶解后已充分釋放果肉組織中的酚類物質(zhì)，總酚含量達到峰值，而在發(fā)酵過程中因氧化和微生物代謝作用有所降低[20-21]。

2.3 大果山楂酒發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化

在大果山楂酒發(fā)酵過程中，對不同時段的樣品檢測了DPPH自由基清除能力和ABTS+·清除能力，以此來判斷大果山楂酒抗氧化活性與總酚含量變化的相關性。大果山楂酒釀造期間自由基清除能力的變化如圖3所示。

圖3 大果山楂酒釀造期間自由基清除能力的變化Fig.3 Changes of free radical scavenging ability during the brewing period of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine

如圖3所示，發(fā)酵前的大果山楂原漿自由基清除能力最高，發(fā)酵開始后，果酒的自由基清除能力有所下降。在整個發(fā)酵過程中，DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力基本保持較小的變化幅度，這個變化與果酒中總酚含量變化趨勢基本相似，說明大果山楂酒的抗氧化能力主要與總酚含量有關。通過相關性分析可知，大果山楂酒抗氧化能力與其總酚含量呈正相關。這一現(xiàn)象與報道的白葡萄酒、紅葡萄酒、果酒和糯米酒發(fā)酵過程中酒樣的抗氧化活性變化相一致[22-23]。此外，DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力二者較為一致，通過Person相關性分析，它們的相關系數(shù)為 0.774（p＜0.05）。

2.4 大果山楂酒發(fā)酵過程中芳香成分的變化

在大果山楂酒發(fā)酵過程中，對不同時段樣品的芳香物質(zhì)進行檢測，對樣品中相對含量超過0.5%的成分進行了統(tǒng)計分析，大果山楂酒發(fā)酵過程中各類香氣物質(zhì)含量的變化如圖4所示，大果山楂酒發(fā)酵過程中各種香氣物質(zhì)相對含量的變化如表1所示。大果山楂發(fā)酵前的大果山楂原漿中含有豐富的香氣成分，發(fā)酵成果酒之后仍然能保持相應的香氣成分。

圖4 大果山楂酒發(fā)酵過程中各類香氣物質(zhì)含量的變化Fig.4 Changes of the contents of various aroma substances during the fermentation of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine

表1 大果山楂酒發(fā)酵過程中各種香氣物質(zhì)相對含量的變化Table 1 Changes of relative contents of various aroma substances during the fermentation of Malus doumeri(Bois）Chevalier wine mg/100 mL

從動態(tài)發(fā)酵過程中檢測出51種成分，由圖4可知，主要是酯類、醇類和醛酮類成分，其特征成分包括苯甲醛、苯乙醇、異辛醇、己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯、3-羥基己酸乙酯、苯乙醛等，這些成分也是常見的水果芳香成分，共同構成大果山楂原味果香[24-28]。使得發(fā)酵之后的大果山楂酒具有香檳的香氣。

在大果山楂酒發(fā)酵過程及結束后形成的果酒中，芳香風味成分種類及含量與發(fā)酵前的大果山楂原漿相比均發(fā)生了明顯變化。由圖4可知，發(fā)酵6 h～24 h醇類、酯類含量呈上升趨勢，這可能是因為醇與?；o酶A是酯合成的底物，隨著醇類含量的上升，酯類含量也相應上升[29]，適宜的醇類物質(zhì)含量可將酯類物質(zhì)香氣凸顯出來，使得香氣更加協(xié)調(diào)。發(fā)酵結束后樣品中酯類和醇類成分的含量均有顯著提高，這些成分中辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯和棕櫚酸乙酯等屬于發(fā)酵產(chǎn)生的新的代謝酯香成分。

由圖4和表1可知，在發(fā)酵前，己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯和3-羥基己酸乙酯含量占酯類物質(zhì)的60.5%。而在整個發(fā)酵過程中，辛酸乙酯占酯類物質(zhì)含量基本保持在14.5%～36.9%，而辛酸乙酯具有類似白蘭地的香氣并帶有甜味。發(fā)酵結束后，辛酸乙酯和癸酸乙酯占酯類物質(zhì)含量最高，達到55.74%。苯乙醇作為原果芳香成分，同時也是酵母代謝產(chǎn)生的特征性成分，其含量增加量最高，發(fā)酵結束時占醇類物質(zhì)的89.4%，苯乙醇不僅具有殺菌作用，還能賦予果酒玫瑰和茉莉花香，給人產(chǎn)生柔和愉悅的感覺。大果山楂原漿香味成分在發(fā)酵過程中存在變化，總體上香味因發(fā)酵的蒸騰作用有所減弱。其中異辛醇、己酸乙酯、2，4-己二烯酸乙基酯、3-羥基己酸乙酯、乙酸苯乙酯、鄰苯二甲酸二乙酯、3-甲硫基丙酸乙酯、苯甲酸乙酯等原果香味成分雖有變化，但保留量也相對較多，保留率為50%～90%，這些成分屬于識別大果山楂酒的重要原果香味。以上酯類和醇類特征成分共同構成了大果山楂酒的淡雅清香。但苯甲醛、苯乙醛、順-9-十六碳烯酸甲酯等含量較高的原果香味成分在發(fā)酵終點基本檢測不到。

3 結論

通過分析不同發(fā)酵時段樣品的總酚含量、自由基清除能力以及利用HS-SPME結合GC-MS對大果山楂酒發(fā)酵過程中的香氣成分進行定量分析。結果表明，經(jīng)成分保護性預處理和果酒發(fā)酵，大果山楂成分可實現(xiàn)有效釋放，獲得較快的干型果酒發(fā)酵速度，既保證了生產(chǎn)效率，同時對提高果酒品質(zhì)也有重要作用。在發(fā)酵過程中，總酚含量略有損失，但保存率均在80%以上，而且其自由基清除能力與總酚含量高度關聯(lián)。快速發(fā)酵對形成大果山楂酒類似香檳特征的淡雅清香也十分重要，除形成新的代謝性酯類和醇類酒香成分以外，原果芳香成分保留量較高?；谝陨显囼灲Y果，利用大果山楂可以開發(fā)高品質(zhì)果酒，但在后期陳釀、碳酸化調(diào)配等工藝技術等方面還值得進一步研究和探索。