中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值在非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后評估中的臨床意義及相關(guān)機制研究

尹蕾 楊旭東 楊悅 牛星鑒 周曉平 姬宏飛 王一然

肺癌是最常見的惡性腫瘤，高居全球惡性腫瘤死亡率之首，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占85%[1]。確定有效預(yù)后判定指標(biāo)能更好指導(dǎo)NSCLC診療。有研究證實，腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)是實體瘤腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵因素[2]。中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(Neutrophils to lymphocytes ratio，NLR)是反映中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞間動態(tài)平衡的炎癥指標(biāo)，綜合反映患者免疫狀態(tài)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，治療前NLR水平是宮頸癌患者重要預(yù)后指標(biāo)，高NLR預(yù)示患者預(yù)后不良[3]。血清淀粉樣蛋白酶A(Serum amyloid A，SAA)是一種急性期蛋白，在炎癥過程中，SAA表達(dá)上升，具有類似細(xì)胞因子特性及免疫相關(guān)功能[4]。目前NSCLC中NLR對患者預(yù)后的預(yù)測作用及相關(guān)機制報道較少。本研究旨在評估NLR對NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測作用并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2007年1月—2009年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的經(jīng)胸部放射治療±同步化療的302例NSCLC患者做建模組，2010年1月—2010年6月的96例患者做驗證組。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會審查通過，患者簽署知情同意書。

1.2 隨訪情況

患者出院后均接受隨訪。前5年每6個月進(jìn)行一次隨訪，5年后每12個月進(jìn)行一次隨訪。獲得無病生存期(Disease-free survival，DFS)和總生存期(Overall survival，OS)。DFS定義為治療開始到疾病復(fù)發(fā)或因疾病進(jìn)展導(dǎo)致死亡的時間；OS定義為治療開始到死亡或末次隨訪的時間。末次隨訪時間為2018年12月。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺上皮細(xì)胞系L132和人肺癌細(xì)胞系NCI-H2170、NCI-H520、NCI-H1299、A549保存于黑龍江省腫瘤防治研究所，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 提取中性粒細(xì)胞

收集4 mL健康人和NSCLC患者外周血，應(yīng)用Ficoll-Hypaque法分離中性粒細(xì)胞。分別加入0 μM、0.2 μM、0.5 μM和1 μM的SAA(Peprotech，Rocky Hill，NJ)，孵育12 h。

1.5 免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)

將4 μm腫瘤組織切片，經(jīng)脫蠟、水化、熱修復(fù)、H2O2阻斷后與SAA或CD66b抗體(Abcam，Cambridge，UK)4℃過夜。次日孵二抗，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，封片，鏡下觀察。按染色強度和腫瘤細(xì)胞陽性百分比確定SAA陽性表達(dá)，弱染或陽性百分比≤5%為陰性；中強染或陽性百分比>5%為陽性。腫瘤內(nèi)浸潤的CD66b陽性中性粒細(xì)胞定義為CD66b+中性粒細(xì)胞，5%為界值。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

按ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，USA)說明書檢測外周血SAA表達(dá)，應(yīng)用Bio-Rad 680酶標(biāo)儀(BioRad Laboratories，Tokyo，Japan)在450 nm波長處測吸光度。

1.7 RNA提取和定量RT-PCR

收集培養(yǎng)細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，Osaka，Japan)合成cDNA，按SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(TOYOBO，Osaka，Japan)說明書，進(jìn)行熒光定量PCR。引物序列如下：β-actin 5′-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3′，5′-CATCAGGATGCCAGTGGT-3′；SAA 5′-CCTGGGCTGCAGAAGTGATCAGCGA-3′，5′-AGTCCTCCGCACCATGGCCAAAGAA-3′。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印記

收集肺癌細(xì)胞及中性粒細(xì)胞，RIPA法裂解細(xì)胞，BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠中電泳，NC轉(zhuǎn)膜，封閉后，與SAA(1∶500稀釋)、Caspase3(1∶500稀釋)、Bcl-2(1∶500稀釋)或β-actin抗體 (1∶500稀釋)(Abcam，Cambridge，UK)4℃過夜，次日孵二抗(1∶10 000稀釋)，ECL法顯色。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)分析

Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(Becton Dickinson，CA，USA)檢測中性粒細(xì)胞凋亡。將SAA處理的中性粒細(xì)胞PBS洗后，重懸500 μL PBS中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，Accuri C6流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.10 統(tǒng)計分析

SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，Image J1.8.0軟件分析免疫印跡條帶。ROC曲線確定NLR預(yù)測NSCLC患者放療后復(fù)發(fā)臨界值，χ2檢驗和Fisher精確檢驗分析NLR與各項參數(shù)的關(guān)系。Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗分析NLR與OS和DFS的關(guān)系。多因素Cox回歸分析預(yù)后影響因素。應(yīng)用R 3.6.0軟件建立列線圖模型，繪制ROC曲線評估模型預(yù)測性能。Pearson線性相關(guān)分析血清中SAA與中性粒細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性。t檢驗進(jìn)行兩組間比較，方差分析進(jìn)行多組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模組和驗證組NSCLC患者一般特征

建模組患者302例，驗證組患者96例。表1結(jié)果顯示，建模組和驗證組臨床特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 NLR預(yù)測NSCLC患者放療后復(fù)發(fā)

ROC曲線顯示，建模組中NLR對NSCLC患者放療后復(fù)發(fā)有一定的診斷價值(AUC=0.679，95%CI：0.629～0.753，P=0.013)，NLR最佳分界值為2.53，敏感性為0.891，特異性為0.559；淋巴細(xì)胞絕對計數(shù)(Absolute lymphocyte count，ALC)和中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(Absolute neutrophil count，ANC)的診斷價值無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.3 NLR與臨床指征關(guān)系

建模組患者分高NLR組(≥2.53，137例)和低NLR組(<2.53，165例)。高NLR組患者ANC高于低NLR組患者(4.78±0.237vs. 3.81±0.395，t=3.617，P<0.001)。表2結(jié)果顯示，ECOG評分、病理分期、腫瘤分級與NLR有關(guān)(P<0.01)。

2.4 NLR與疾病進(jìn)展時間關(guān)系

建模組患者分低NLR組和高NLR組，低NLR組患者OS和DFS顯著延長(χ2=16.798，P<0.01；χ2=22.809，P<0.01)(圖2)。

2.5 NSCLC患者預(yù)后影響因素

單因素分析顯示，建模組患者NLR與OS和DFS相關(guān)(P<0.001)(表3)。多因素逐步Cox回歸的最優(yōu)模型中，性別與NLR是OS的獨立預(yù)后因素(P<0.05)(表4)。

2.6 列線圖模型的建立和驗證

根據(jù)多因素Cox回歸分析結(jié)果建立OS列線圖模型(圖3A)。OS列線圖模型對建模組患者3、5年生存率預(yù)測的AUC值分別為0.723和0.625，對驗證組3、5年生存率預(yù)測的AUC值分別為0.749和0.705(圖3B-C)，說明模型有較好的預(yù)測性能。

圖1 患者治療前NLR、ALC、ANC的ROC曲線Figure 1 ROC curves for pre-treatment NLR，ALC and ANC in NSCLC patients

表1 建模組和驗證組NSCLC患者一般特征[ n(%)]

圖2 治療前NLR水平對OS和DFS的影響Figure 2 Kaplan-Meier curves of OS and DFS based on NLR

表2 患者臨床指征與NLR的關(guān)系[ n(%)]

圖3 列線圖模型及模型預(yù)測性能ROC曲線Figure 3 The nomogram model and ROC curvesNote：A.The nomogram model of OS；B.The ROC curve of modeling group；C.The ROC curve of validation group.

表3 影響患者預(yù)后單因素Cox分析

表4 患者預(yù)后影響因素的多因素Cox回歸分析

2.7 高NLR提示預(yù)后不良機制分析

免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)血液NLR高的患者肺癌組織中中性粒細(xì)胞浸潤度高，同時伴SAA高表達(dá)(圖4A-D)。ELISA結(jié)果顯示NSCLC患者SAA顯著升高(P<0.01)(圖4E)，患者SAA與中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.707，P<0.01)(圖4F)。與L132細(xì)胞相比，肺癌細(xì)胞中SAA mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)(圖4G-H)。

2.8 SAA對中性粒細(xì)胞凋亡的影響

如圖5A所示，與對照組相比，SAA處理中性粒細(xì)胞后顯著抑制中性粒細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴性(P<0.05)。SAA處理后Caspase-3表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高(P<0.05)(圖5B)，說明SAA抑制中性粒細(xì)胞凋亡。

3 討論

隨著腫瘤研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)炎癥與腫瘤間存在密切關(guān)聯(lián)。中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比值(Lymphocyte to monocyte ratio，LMR)及NLR都能反應(yīng)機體炎癥水平。本課題組在Luminal型乳腺癌和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，治療前LMR與患者預(yù)后有關(guān)；治療前NLR低的宮頸癌患者同步放化療預(yù)后更好，NLR對化療方案選擇有提示作用[3，5]。

本研究在建模組中發(fā)現(xiàn)NLR<2.53的NSCLC患者比NLR≥2.53患者的生存時間更長，NLR與ECOG、病理分期和腫瘤分級有關(guān)。多因素分析顯示NLR和性別是NSCLC患者OS的獨立預(yù)后因素，建立OS列線圖模型，驗證后提示模型預(yù)測性能較好。多項研究表明治療前高NLR提示NSCLC患者預(yù)后差，NLR可作為預(yù)后判定指標(biāo)來評估NSCLC患者預(yù)后[6-8]。

圖4 NSCLC患者SAA與中性粒細(xì)胞表達(dá) Figure 4 The expression of SAA and neutrophils in NSCLC patientsNote：A-B.The positive and negative expression of SAA by IHC(100×)；C-D.The high and low infiltration of CD66b+ neutrophils by IHC(100×)；E.The concentration of SAA in plasma from 21 normal controls and 37 NSCLC patients by ELISA；F.The correlation between SAA and neutrophils；G-H.The expression of SAA at levels of mRNA and protein.##P< 0.01，when compared with the normal controls.**P< 0.01，when compared with L132 cells.

圖5 SAA對中性粒細(xì)胞凋亡影響Figure 5 Effects of SAA on apoptosis of neutrophilsNote：A.The analysis of apoptosis by flow cytometry；B.The expression of apoptosis-related protein.*P< 0.05，**P< 0.01，when compared with the control group.

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織和細(xì)胞系中SAA顯著增加，有研究表明，腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞相互作用，表達(dá)并分泌SAA[9]。SAA對免疫細(xì)胞有趨化性，引起白細(xì)胞浸潤、促中性粒細(xì)胞黏附，釋放細(xì)胞因子[4，10]。黑色素瘤分泌SAA誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞向免疫抑制型中性粒細(xì)胞分化，誘導(dǎo)其分泌白介素10促腫瘤生長[11]。本研究發(fā)現(xiàn)SAA與中性粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，SAA抑制中性粒細(xì)胞凋亡。Christenson等[12]研究發(fā)現(xiàn)SAA通過P2X7敏感通路抑制中性粒細(xì)胞凋亡，在自發(fā)凋亡和FAS誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞中均有抑制作用?？沟蛲龅闹行粤＜?xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等炎性因子，促血管生成、誘導(dǎo)DNA損傷，促腫瘤發(fā)展[13-14]。

綜上所述，術(shù)前NLR水平可作為預(yù)測NSCLC患者預(yù)后指標(biāo)。本研究初步驗證NSCLC中SAA抑制中性粒細(xì)胞凋亡，影響NLR水平。接下來本課題組將進(jìn)一步研究在NSCLC中SAA抑制中性粒細(xì)胞凋亡的通路機制、SAA對中性粒細(xì)胞分泌的炎性因子的影響作用，繼續(xù)探索SAA在NSCLC中所發(fā)揮的作用。