Podoplanin-CLEC2活化血小板與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展

李銘銘 岳晨曦 張夢琳 黃文娟 綜述 王瑞濤 審校

癌癥和血栓性并發(fā)癥之間有著密切的聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，在惡性腫瘤患者中，靜脈血栓栓塞(Venous thromboembolism，VTE)的發(fā)生率為10%～20%，動脈血栓栓塞(Arterial thromboembolism，ATE)的發(fā)生率為1%～4.7%[1-2]。癌癥相關(guān)性血栓形成是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的第二大原因[3]。

越來越多的證據(jù)表明，血小板活化在癌癥相關(guān)性血栓形成中發(fā)揮重要作用。同時，癌細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板活化還促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展和擴(kuò)散。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，平均血小板體積和血小板分布寬度與腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤等腫瘤預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。血小板聚集在腫瘤細(xì)胞周圍可保護(hù)它們免受剪切力和血液中的自然殺傷細(xì)胞的傷害，并為腫瘤細(xì)胞提供了與血管壁粘附的支架。此外，活化血小板分泌的血管生成因子和生長因子可促進(jìn)腫瘤生長和血管生成[6]。腫瘤細(xì)胞可通過表達(dá)膜蛋白Podoplanin刺激血小板活化。血小板表面C型凝集素樣受體2(C-type lectin-like receptor-2，CLEC2)是Podoplanin的受體。研究證實(shí)，Podoplanin和CLEC2之間相互作用，通過活化血小板在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮多種生理和病理作用。

1 Podoplanin與CLEC2概述

Podoplanin是血小板受體CLEC2唯一的內(nèi)源性配體[7]。Podoplanin是一種36～43 kD的唾液酸蛋白樣的單跨膜糖蛋白，由一個短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和一個胞外結(jié)構(gòu)域組成，含有大量的絲氨酸、蘇氨酸殘基作為潛在的O-糖基化位點(diǎn)。Podoplanin具有四個血小板聚集刺激(PLAG)結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域具有重復(fù)性和高度保守性。其中，PLAG3和PLAG4兩個結(jié)構(gòu)域均含有谷氨酸、天冬氨酸雙重肽和O-糖基化蘇氨酸，它們是CLEC2和Podoplanin結(jié)合、誘導(dǎo)血小板聚集的重要部位[8]。CLEC2是分子量為32 kDa的Ⅱ型跨膜蛋白，屬于非經(jīng)典型凝集素樣受體。CLEC2的胞質(zhì)尾部具有半免疫受體酪氨酸基激活基序(hemi-ITAM)，Podoplanin與CLEC2兩者結(jié)合后，該基序通過Src、Syk酪氨酸激酶的磷酸化介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。Syk通過其兩個Src同源2結(jié)構(gòu)域識別酪氨酸磷酸化，從而被激活?；罨腟yk相互作用導(dǎo)致磷脂酶Cγ2(PLCγ2)磷酸化和激活，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高和蛋白激酶C活化，繼而引發(fā)血小板活化[9]。

2 Podoplanin-CLEC2活化血小板參與腫瘤發(fā)生發(fā)展

CLEC2高表達(dá)于血小板和巨核細(xì)胞，少量由B細(xì)胞和髓細(xì)胞表達(dá)，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞亞群[9]。在惡性腫瘤中，CLEC2與表達(dá)Podoplanin的腫瘤細(xì)胞相互作用促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Podoplanin作為一種淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、宮頸癌、鼻咽癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等[10-14]。Podoplanin的過度表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移有關(guān)[11，15]。在Podoplanin表達(dá)陽性的小鼠腫瘤模型中，抑制Podoplanin表達(dá)可減少轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的數(shù)量[16]。此外，Podoplanin在腫瘤內(nèi)的高表達(dá)水平與癌癥相關(guān)死亡率的增加有關(guān)[17]。根據(jù)最近的研究表明，Podoplanin的表達(dá)與許多實(shí)體腫瘤的更高分級級別和晚期有關(guān)[18]。

Podoplanin-CLEC2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑目前仍在探索中。研究證實(shí)，Podoplanin胞質(zhì)尾可結(jié)合細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白(Ezrin-radixin-moesin，ERM)，進(jìn)而與細(xì)胞質(zhì)膜和肌動蛋白絲相互作用，可參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動[6]，同時參與促進(jìn)胚胎發(fā)育和癌癥期間的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)[19-20]。此外，Podoplanin-ERM相互作用還參與淋巴管生成和免疫應(yīng)答[20]，以及通過特殊的細(xì)胞表面突起(侵襲性足)募集糖蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲能力[21]。

2.1 Podoplanin-CLEC2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖

Podoplanin-CLEC2與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。在口腔不典型增生患者中的研究發(fā)現(xiàn)，Podoplanin表達(dá)水平隨著口腔上皮細(xì)胞異形程度的增加而增加，猜測Podoplanin表達(dá)程度可用于推測發(fā)生口腔癌變的風(fēng)險(xiǎn)[22]。Shirai等[23]報(bào)道，血小板與Podoplanin表達(dá)陽性的黑色素瘤B16F10細(xì)胞共培養(yǎng)，可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖。

2.2 Podoplanin-CLEC2促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

2.2.1 Podoplanin-CLEC2促進(jìn)腫瘤血行轉(zhuǎn)移 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最主要的特征之一，主要包括血行轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移。Podoplanin通過血小板受體CLEC2誘導(dǎo)血小板聚集，有利于腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移。Xu等[24]為了探討阻斷Podoplanin對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，建立了惡性黑色素瘤異種移植模型。然后從小鼠尾靜脈注射抗Podoplanin封閉抗體SZ168，結(jié)果顯示小鼠黑色素瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移受到明顯抑制。此外，將抗CLEC2抗體2A2B10注射到小鼠體內(nèi)，隨后注射表達(dá)Podoplanin的黑色素瘤細(xì)胞系B16F10，結(jié)果顯示可顯著抑制肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)量[23]。以上結(jié)果提示Podoplanin與CLEC2相互作用，有助于循環(huán)腫瘤細(xì)胞在血流中的存活和/或粘附。

2.2.2 Podoplanin-CLEC2促進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移 Podoplanin-CLEC2在淋巴管發(fā)育中起著重要的作用，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移[25]。最新研究發(fā)現(xiàn)，相比于脂溢性皮炎而言，Podoplanin在非黑色素瘤皮膚癌(包括基底細(xì)胞癌和鱗狀細(xì)胞癌)中的表達(dá)水平明顯上調(diào)。其在非黑色素瘤皮膚癌中的表達(dá)水平與淋巴管密度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量呈正相關(guān)[26]。比利時癌癥中心的研究表明，抑制Podoplanin表達(dá)可降低小鼠乳腺癌的轉(zhuǎn)移，認(rèn)為Podoplanin可作為乳腺癌患者潛在的預(yù)后指標(biāo)[25]。同樣在肺鱗癌中研究證實(shí)，Podoplanin表達(dá)水平與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有顯著相關(guān)性[27]。然而，Podoplanin在宮頸癌中的作用是獨(dú)特的。研究證實(shí)，相比于對照組，Podoplanin陽性表達(dá)的宮頸癌患者存活率更高[12]。以上結(jié)果表明，Podoplanin有望成為評估部分惡性腫瘤預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，其有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。

2.3 Podoplanin-CLEC2促進(jìn)癌癥相關(guān)血栓形成

Podoplanin-CLEC2誘導(dǎo)的血小板聚集作用可能并不局限于腫瘤惡性進(jìn)展。K?nigsbrügge等[28]應(yīng)用前瞻性的“維也納癌癥和血栓形成研究(CATS)”隊(duì)列，對200多名原發(fā)性腦腫瘤患者(大部分為高級別膠質(zhì)瘤)進(jìn)行隨訪研究。研究的主要終點(diǎn)是VTE的發(fā)生，目的是確定惡性腫瘤患者發(fā)生高VTE風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果顯示，約14%的原發(fā)性腦腫瘤患者出現(xiàn)了客觀證實(shí)的VTE。Riedl等[17]用免疫組化方法對腦瘤標(biāo)本中Podoplanin的表達(dá)水平和血小板聚集情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示Podoplanin的過度表達(dá)與腫瘤內(nèi)血栓形成和VTE風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)。此外，表達(dá)Podoplanin的腦瘤患者血小板計(jì)數(shù)降低，血漿D-二聚體水平升高。這些數(shù)據(jù)表明Podoplanin上調(diào)可能誘發(fā)患者血液高凝狀態(tài)，從而可能觸發(fā)VTE。Podoplanin-CLEC2相互作用在癌癥相關(guān)血栓形成中起著重要作用。

Shirai等[23]在荷瘤小鼠模型中觀察到，接種了Podoplanin陽性的B16F10細(xì)胞后，小鼠的背部皮膚中有大量血栓形成。抑制CLEC2表達(dá)后，小鼠血栓形成受到極大抑制，表明Podoplanin-CLEC2相互作用可刺激血小板活化，導(dǎo)致血栓形成。然而，由于Podoplanin也在正常組織中表達(dá)(包括腎足細(xì)胞、Ⅰ型肺泡細(xì)胞、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞)，導(dǎo)致癌癥相關(guān)血栓形成的Podoplanin可能并不局限于腫瘤細(xì)胞表面[29]。雖然這些細(xì)胞中的Podoplanin不能獲得血小板CLEC2，然而，在病理狀態(tài)下，可誘導(dǎo)異位Podoplanin表達(dá)。Payne等[30]報(bào)道了在靜脈血栓形成過程中，Podoplanin在血管壁的表達(dá)上調(diào)，這可能是由血栓炎癥引起的。此外，據(jù)報(bào)道，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)Podoplanin，這與肺癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)[6]。這種病理表達(dá)的Podoplanin也可能通過與血小板CLEC2的相互作用參與癌相關(guān)血栓形成。

3 靶向Podoplanin-CLEC2在腫瘤治療中的作用

3.1 抗血小板藥物存在出血風(fēng)險(xiǎn)

由于Podoplanin-CLEC2活化血小板，在癌癥相關(guān)血栓形成及腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，抑制血小板可能成為有效靶點(diǎn)。血小板活化和聚集涉及多種機(jī)制，臨床上常用的抗血小板藥物是二磷酸腺苷P2Y12受體阻斷劑，如氯吡格雷、普拉格雷。血小板活性也可通過抑制環(huán)氧化酶(如阿司匹林)或血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體(如阿昔單抗或替羅非班)而受到影響。先前的研究表明，阿司匹林在體外能夠降低Podoplanin介導(dǎo)的血小板聚集[31]。根據(jù)血小板聚集增加癌癥相關(guān)血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)，ASCO指南推薦，低劑量阿司匹林或抗凝劑(如低分子肝素)可用于多發(fā)性骨髓瘤患者的一級血栓預(yù)防[32]。然而，與抗凝劑類似，阿司匹林和其他抗血小板藥物也有出血的風(fēng)險(xiǎn)，這限制了它們的臨床應(yīng)用[33]。

3.2 CLEC2和Podoplanin作為藥物靶點(diǎn)

阻斷CLEC2和Podoplanin的靶向藥物在臨床前研究中已顯示出作為抗癌藥物的前景。理論上，這些藥物可以減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、癌相關(guān)血栓形成。

人Podoplanin與CLEC2的結(jié)合依賴于其本身的PLAG3和PLAG4結(jié)構(gòu)域。在此過程中，PLAG4結(jié)構(gòu)域起主導(dǎo)作用。抗Podoplanin靶向藥物正是根據(jù)這一原理研制，它能夠識別Podoplanin的PLAG3或PLAG4的部分區(qū)域，以發(fā)揮效應(yīng)[34]。研究證實(shí)，識別Podoplanin的PLAG3的單克隆抗體NZ-1對Podoplanin-CLEC2活化血小板具有抑制作用[35]。此結(jié)果在其他Podoplanin單抗(如P2-0和MS-1)也得到驗(yàn)證[34，36]。研究還發(fā)現(xiàn)Podoplanin表達(dá)被抑制后，血栓體積會明顯縮小[30]。此外，在小鼠模型中研究證實(shí)，Podoplanin單抗與其他治療手段聯(lián)合治療，能增強(qiáng)抗腫瘤療效。Podoplanin單抗NZ-12和培美曲塞聯(lián)合在治療小鼠惡性胸膜間皮瘤中效果顯著[37]。NZ-1聯(lián)合近紅外光免疫療法，對惡性胸膜間皮瘤有顯著的抗腫瘤作用[38]。大鼠-人嵌合抗體NZ-12可用于惡性胸膜間皮瘤放射免疫治療，增強(qiáng)抗腫瘤作用[39]。這些證據(jù)有力地表明Podoplanin單抗具有良好的臨床應(yīng)用前景。然而，由于Podoplanin在正常組織中也有表達(dá)[29]，應(yīng)注意其潛在的藥物不良反應(yīng)。為了解決這個問題，已經(jīng)報(bào)道了特異性識別癌細(xì)胞上異常糖基化Podoplanin的LpMab單克隆抗體系列[40]。盡管該抗體很有希望避免副作用，但它可能無法識別慢性炎癥期間內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞中Podoplanin上調(diào)，會參與癌癥相關(guān)的血栓形成。

研究還證實(shí)，CLEC2缺乏的小鼠在不增加出血的情況下發(fā)生VTE的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低[37]。且CLEC2缺乏的小鼠出血時間并無明顯延長[41-42]。這表明血小板受體CLEC2在生理止血中的作用較小。同時考慮到CLEC2的表達(dá)高度局限于血小板和巨核細(xì)胞，故靶向CLEC2治療可能具有優(yōu)勢。迄今為止，抗CLEC2抗體[23]、CLEC2結(jié)合小分子[43]和突變重組紅細(xì)胞素[44]已被報(bào)道可與CLEC2結(jié)合，并阻止CLEC2與Podoplanin結(jié)合。但臨床應(yīng)用前仍需進(jìn)一步研究。這些新的見解為癌癥相關(guān)血栓形成及腫瘤轉(zhuǎn)移的治療和預(yù)防提供了新的策略。

4 小結(jié)與展望

部分癌細(xì)胞在其表面表達(dá)不同的Podoplanin。Podoplanin通過結(jié)合血小板受體CLEC2活化血小板，與腫瘤惡性進(jìn)展、癌癥相關(guān)血栓形成及預(yù)后不良有關(guān)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，Podoplanin和CLEC2可能是惡性腫瘤治療的有吸引力的藥物靶點(diǎn)。然而，Podoplanin在正常組織中廣泛表達(dá)[29]。因此，需要進(jìn)一步的研究來探索Podoplanin及CLEC2靶向藥物在體內(nèi)的潛在毒性和優(yōu)勢。