miR-182靶向調(diào)控PI3K/AKT/FOXO3a信號通路對膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究

賈曉瓊 孫秋穎 劉曉宇 信濤

膠質(zhì)瘤是臨床較為常見的原發(fā)性惡性顱腦腫瘤疾病，病灶組織呈浸潤性生長，故外科手術(shù)難以徹底切除，具有術(shù)后復(fù)發(fā)率高、治療困難、生存時間短等特點[1-2]。人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Glioma stem cells，GSCs)具有自我更新、無限增殖、多向分化等生物學(xué)功能的腫瘤細(xì)胞，其可侵襲和播散至遠(yuǎn)處腦組織，是膠質(zhì)瘤疾病復(fù)發(fā)及難以根治的重要原因[3-4]。因此有效抑制GSCs生物學(xué)行為是治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵所在。miR-182是一種定位于7q32.2染色體的微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)，其可通過靶向調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinas B，PI3K/AKT)信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長、增殖和抑制凋亡[5]，且人類叉頭框O蛋白3a(FOXO3a)是PI3K/AKT信號通路的下游細(xì)胞因子，主要受AKT調(diào)控[6]。目前miR-182對于GSCs增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響研究較少，且缺乏相關(guān)的機(jī)制研究，因此本研究擬觀察miR-182對GSCs生物學(xué)行為的影響，并探討其靶向調(diào)控PI3K/AKT/FOXO3a信號通路的作用機(jī)制，從而為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 膠質(zhì)瘤患者及組織標(biāo)本來源

20例膠質(zhì)瘤患者均為內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科2014年1月—2015年10月住院行外科手術(shù)切除治療的患者，男15例，女5例，年齡47～68歲，平均年齡(56.7±8.2)歲，術(shù)后病理確診為星形細(xì)胞瘤7例，混合膠質(zhì)瘤5例，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤4例，間變性室管膜瘤4例(其中1例經(jīng)實驗室分離，并最終成功培養(yǎng)出GSCs)。所有患者均知情本研究方案及研究目的，本研究方案已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 GSCs分離、培養(yǎng)及分選 將采集到的新鮮膠質(zhì)瘤組織均勻剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，然后消化處理制成含細(xì)胞上清液，置于DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，同時加入培養(yǎng)細(xì)胞因子，培養(yǎng)2 d后收集懸浮細(xì)胞球，采用免疫磁珠技術(shù)細(xì)胞分選儀對CD133+GSCs進(jìn)行分選。

1.2.2 CD133+GSCs球免疫組織化學(xué)檢測 CD133+GSCs球貼壁玻片后采用PBS溶液洗滌，然后置于山羊血清溶液中在室溫環(huán)境下孵育1 h，依次加入一抗(兔抗-CD133，濃度為1∶100)抗體及鼠抗-nestin(濃度為1∶100)抗體，最后孵育過夜，再次PBS溶液洗滌后與二抗(濃度為1∶100)一起在室溫下孵育1 h，PBS洗滌后使用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。磷酸緩沖鹽溶液替代一抗作為陰性對照組，正常人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞作為陽性對照組，采用相關(guān)分析軟件采集和分析免疫組織化學(xué)圖像。

1.2.3 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期內(nèi)的CD133+GSCs接種至6孔板中，分為空白對照組(不做特殊處理)、miR-182 mimics組(采用Lipofectamine 2000將miR-182 mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞)及陰性對照組(采用Lipofectamine 2000將無意義序列轉(zhuǎn)染細(xì)胞)，每組設(shè)3個重復(fù)。轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下計算轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 miR-182 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法檢測各組細(xì)胞miR-182 mRNA表達(dá)水平，首先提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA，然后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測miR-182 mRNA表達(dá)水平，miR-182：上游引物，5′-ACACTCCAGCTGGGTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ACT-3′，下游引物，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG TTGAGAGTGTGAG-3′，電泳產(chǎn)物大小為435 bp。β-actin：上游引物，5′-TCACCAACTGG GACGACAT-3′，下游引物，5′-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3′，電泳產(chǎn)物大小為173bp。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，然后采用相應(yīng)軟件對目標(biāo)條帶予以分析和計算，miR-182/β-actin 作為miR-182 mRNA的相對定量表達(dá)水平。

1.2.5 GSCs增殖檢測 采用CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒檢測三組GSCs增殖情況。各組細(xì)胞完成轉(zhuǎn)染12 h后，將細(xì)胞接種到96孔板中，接種密度為2×103個/100 μL，接種后12、36、60 h分別加入CCK-8溶液，37℃條件下培養(yǎng)4 h，在波長450 nm處進(jìn)行吸光度測定，對各組細(xì)胞增殖率進(jìn)行計算。

1.2.6 GSCs凋亡檢測 將腫瘤壞死因子(TNF-α)分別加入到空白對照組、陰性對照組和miR-182 mimics實驗組的培養(yǎng)基中，終濃度為100 ng/L，轉(zhuǎn)染后24、48和72 h采用流式細(xì)胞儀檢測各組GSCs凋亡情況(Annexin-V、PI染色陽性)。

1.2.7 GSCs遷移及侵襲能力檢測 采用細(xì)胞劃痕法檢測各組細(xì)胞遷移能力。選取對數(shù)生長期細(xì)胞，在6孔板進(jìn)行鋪板，細(xì)胞數(shù)量為5×105個/孔，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，取各孔中央位置，用黃槍頭槍尖劃出一條劃痕，且劃痕貫穿培養(yǎng)整個孔，保持各孔細(xì)胞劃痕的寬度一致，用吸管吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS漂洗(2～3次)，將懸浮細(xì)胞和細(xì)胞碎片移除，最后對各孔拍照并將其作為0 h細(xì)胞遷移狀況圖予以保存。隨后將完全培養(yǎng)基重新加入到每孔中，劑量為2.0 mL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為24～48 h，計算各組遷移率。采用Transwell小室檢測各組細(xì)胞侵襲能力，選取對數(shù)生長期細(xì)胞，以DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105個/mL，取100 μL 細(xì)胞接種在Transwell上室內(nèi)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，下室加入DMEM培養(yǎng)液500 μL，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，將濾膜上層的細(xì)胞用棉簽?zāi)ㄈィ瑸V膜以甲醇固定處理5 min，100倍光鏡下選擇5個不同視野的穿過膜的細(xì)胞數(shù)，求平均值。

1.2.8 PI3K/AKT/FOXO3a信號通路相關(guān)蛋白檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測各組細(xì)胞PI3K(P110α)、p-AKT(Ser473)和FOXO3a蛋白表達(dá)水平，抗體工作濃度均為1∶100，同時選擇GAPDH作為內(nèi)參，采用相關(guān)軟件分析和計算目的蛋白相對密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)資料，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量設(shè)計方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSCs培養(yǎng)鑒定結(jié)果

GSCs經(jīng)培養(yǎng)和連續(xù)傳代5次后采用nestin及CD133染色處理后膠質(zhì)瘤干細(xì)胞球呈陽性表達(dá)，且DAPI呈細(xì)胞核著染(圖1)。

圖1 GSCs培養(yǎng)染色鑒定圖像Figure 1 GSCs were identified by staining with nestin and CD133Note：A.GSCs were stained with nestin，showing blue color；B.GSCs were stained with CD133，showing red color；C.GSCs were stained with nestin and CD133，showing merge fluorescence image.

2.2 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較

miR-182 mimics內(nèi)有綠色熒光基團(tuán)(FITC)，轉(zhuǎn)染24 h后將空白對照組、陰性對照組及miR-182 mimics組在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，miR-182 mimics組轉(zhuǎn)染效率為87.5%，而空白對照組、陰性對照組未見綠色熒光表達(dá)(圖2)。

2.3 各組細(xì)胞miR-182 mRNA表達(dá)水平比較

miR-182 mimics組miR-182 mRNA表達(dá)水平(0.527±0.116)明顯高于空白對照組(0.125±0.012)及陰性對照組(0.130±0.015)(P<0.01)，空白對照組與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖3，圖4)。

2.4 各組細(xì)胞不同時間增殖率比較

miR-182 mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48及72 h時的細(xì)胞增殖率明顯高于空白對照組、陰性對照組(P<0.01)，而空白對照組與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

2.5 各組細(xì)胞不同時間凋亡率比較

miR-182 mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24、48及72 h時的細(xì)胞凋亡率明顯低于空白對照組、陰性對照組(P<0.05)，而空白對照組與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

圖2 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下圖像Figure 2 GSC fluorescence microscope images in each group after transfectionNote：A.Fluorescence microscope image showed more cells with green fluorescence after transfection of miR-182 mimics in GSCs(the miR-182 mimics group)；B.Fluorescence microscope image showed no cells with green fluorescence(the blank control group)；C.Fluorescence microscope image showed no cells with green fluorescence(the negative control group).

圖3 各組細(xì)胞miR-182 mRNA表達(dá)水平比較Figure 3 The expression of miR-182 mRNA in each groupNote：**P<0.01，when compared with the miR-182 mimics group.

圖4 各組細(xì)胞miR-182 mRNA電泳圖Figure 4 The expression of miR-182 mRNA in each group by electrophoresisNote：A.RT-PCR products in the miR-182 mimics group；B.RT-PCR products in the blank control group；C.RT-PCR products in the negative control group.

表1 各組細(xì)胞不同時間增殖率比較(%)

表2 各組細(xì)胞不同時間凋亡率比較(%)

2.6 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較

miR-182 mimics組細(xì)胞遷移率[(41.37±3.91)%]和侵襲能力(203±25個)均明顯高于陰性對照組[(19.54±1.87)%，114±11個]及空白對照組[(19.17±1.92)%，118±12個](P<0.01)，而空白對照組與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖5，圖6)。

2.7 各組細(xì)胞PI3K、p-AKT、FOXO3a蛋白表達(dá)水平比較

miR-182 mimics組膠質(zhì)瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組、陰性對照組(P<0.01)，F(xiàn)OXO3a蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對照組、陰性對照組(P<0.01)，而空白對照組與陰性對照組PI3K、p-AKT、FOXO3a蛋白表達(dá)水平比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表3，圖7)。

圖7 各組細(xì)胞PI3K、p-AKT、FOXO3a蛋白表達(dá)水平比較Figure 7 The expression of PI3K，p-AKT and FOXO3a proteins in each group

圖5 各組細(xì)胞遷移能力實驗圖(200×)Figure 5 The ability of cell migration in each group(200×)

圖6 各組細(xì)胞侵襲能力實驗圖(200×)Figure 6 The ability of cell invasion in each group(200×)

表3 各組細(xì)胞PI3K、p-AKT、FOXO3a蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

雖然近些年我國醫(yī)療診治技術(shù)得到迅猛的發(fā)展，但膠質(zhì)瘤患者5年生存率仍低于5%，其發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，臨床上也缺乏治療此疾病的靶向藥物[7-8]。miRNAs作為一類新發(fā)現(xiàn)的癌基因或抑癌基因，其表達(dá)水平出現(xiàn)異常在各種惡性腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，可通過影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為對惡性腫瘤產(chǎn)生影響[9]。其中miR-182是一種具有癌基因作用的miRNAs，可明顯增強(qiáng)多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等功能。國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)[10-12]，miR-182可通過調(diào)控多種基因或蛋白表達(dá)而影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，但其對GSCs生物學(xué)行為的文獻(xiàn)報道相對較少。

GSCs是類似于神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群，其可通過調(diào)控PI3K/AKT、成纖維細(xì)胞生長因子2、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2等信號通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、免疫逃避，從而促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)新生血管形成、術(shù)后疾病復(fù)發(fā)、異質(zhì)性形成，同時還可提高細(xì)胞對放化療的耐受性[13-14]。因此本研究從1例膠質(zhì)瘤患者病灶組織中成功分離出GSCs，經(jīng)實驗室培養(yǎng)及連續(xù)傳代5次后予以nestin、CD133染色鑒定驗證。將miR-182 mimics轉(zhuǎn)染至GSCs后倒置熒光顯微鏡下顯示其轉(zhuǎn)染效率符合隨后的實驗要求，采用RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，miR-182 mimics組miR-182 mRNA表達(dá)水平明顯高于空白對照組及陰性對照組，提示miR-182 mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可明顯提高miR-182 mRNA的表達(dá)水平。然后檢測各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的各種生物學(xué)行為改變，結(jié)果顯示miR-182 mimics組細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力均強(qiáng)于空白對照組及陰性對照組，而凋亡率低于空白對照組及陰性對照組，提示miR-182高水平表達(dá)可增強(qiáng)GSCs增殖、遷移、侵襲能力和抑制細(xì)胞凋亡，對GSCs也具有明顯的類癌基因作用。

研究進(jìn)一步分析miR-182通過何種信號通路影響GSCs的生物學(xué)行為，PI3K/AKT信號通路是連接細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞的重要橋梁，AKT則是該信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其磷酸化后可使得PI3K/AKT信號通路活化，從而有效調(diào)控處于下游部位的相關(guān)信號分子，對細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生重要的影響[15]。而FOXO3a正是PI3K/AKT信號通路下游部位的重要轉(zhuǎn)錄因子，其受到蛋白激酶B和核因子KB激酶B的抑制劑等修飾活化后，其生物學(xué)活性功能出現(xiàn)顯著性改變，從而在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等方面發(fā)揮重要作用[16]。國外較多研究均證實[17-18]，PI3K/AKT/FOXO3a信號通路參與了細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程。本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-182 mimics組PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組和陰性對照組，而FOXO3a蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對照組和陰性對照組，提示miR-182高水平表達(dá)可激活活化GSCs的PI3K/AKT/FOXO3a信號通路。

綜上所述，miR-182可能通過激活活化PI3K/AKT/FOXO3a信號通路而起到增強(qiáng)GSCs增殖、遷移及侵襲能力和抑制細(xì)胞凋亡的作用，有可能成為臨床治療膠質(zhì)瘤的新靶點。本研究還需通過動物實驗研究加以驗證，此外miR-182是否還可通過其他信號通路影響GSCs的生物學(xué)行為仍需繼續(xù)進(jìn)一步探討。