MiR-146a-5p對高脂飲食/鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠腎組織的保護作用*

李 莉 李 松 曹 萌 石小娟 王 雪 王順閣

（1 平頂山市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，平頂山 467000；2 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，衛(wèi)輝 453100）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）占終末期腎臟疾病的45%[1-2]。DN的發(fā)病機制涉及多種因素，足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，幾乎所有的腎小球疾病都與足細胞損傷有關(guān)[3-4]。此外，炎癥增強可直接破壞腎結(jié)構(gòu)，并與DN的進展密切相關(guān)[5]。大量證據(jù)表明，miRNAs（microRNAs）在腎臟疾病中發(fā)揮著重要作用[6]。MiRNAs的失調(diào)已被證實與DN相關(guān)的病理事件有關(guān)，提示miRNAs有望作為DN的診斷生物標記物和治療靶點的可能性[7-8]。例如，miR-29c的過度表達通過靶向3，4脯氨酸增加炎癥反應，促進DN的進展[9]。敲除miR-27a基因能夠降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠腎細胞外基質(zhì)和蛋白尿的積累，并阻止高葡萄糖誘導的系膜細胞增殖[10]。研究已證實miR-146a可抑制葡萄糖誘導的糖尿病視網(wǎng)膜和腎中炎性細胞因子細胞外基質(zhì)蛋白的上調(diào)[11-12]。本研究以高脂飲食（high-fat diet，HFD）和STZ誘導的糖尿病大鼠作為DN模型，探討miR-146a-5p在DN發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

STZ、TUNEL試劑盒購自美國Sigma公司；蘇木精伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒，RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗β-actin、Bax、Bcl-2、caspase 3（cas3）、cleaved cas3抗體購自英國Abcam公司；抗IL-10和iNOS抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗動物

40只健康SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量200 g±20 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SYXK（豫）2016-0002。在實驗過程中，將大鼠置于溫度22℃～24℃和濕度40%～70%，12 h 光/暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，并自由獲得標準的食物和水。

1.3 糖尿病腎病大鼠的誘導及實驗設(shè)計

將40只SD大鼠分為2組，第1組（n=10）以正常大鼠飲食喂養(yǎng)，作為正常對照組，第2組（n=30）以HFD 喂養(yǎng)。飲食包括1%膽固醇、10%豬油，20%蔗糖、9%蛋黃粉和60%基本飲食，大鼠可以自由飲水。HFD 喂食6周后，通過腹腔內(nèi)注射溶于0.1 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.5）中的新鮮制備的STZ（35 mg/kg）誘發(fā)糖尿病，對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。誘發(fā)糖尿病3 d后，從尾靜脈收集大鼠血液以測量空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）。FBG水平≥16.7 mmol/L的動物被認為是糖尿病腎病大鼠，并被選擇進行下一步實驗。將第2組大鼠隨機分為3組（n=10）：模型組（DN）、miR-146a-5p 陰性對照組（mimic 對照組）和miR-146a-5p mimic 處理組（mimic 處理組）。后2組糖尿病腎病大鼠分別經(jīng)尾靜脈分別注射慢病毒包被的miR-146a-5p mimic mock 和miR-146a-5p mimic 序列（上海吉瑪基因），每周2次，共8周，正常對照組和模型組同一時間注射等量生理鹽水。

1.4 血清及樣品采集

實驗結(jié)束最后一天，首先測量各組大鼠24 h 內(nèi)飲水量和尿量，然后采用乙醚麻醉處死大鼠，從腹主動脈中采集血樣，離心血液，血清于－80℃保存；收集右腎，快速冷凍，－80℃保存；左腎保存于4%多聚甲醛溶液中，進行組織學分析及細胞凋亡檢測。

1.5 全自動生化分析儀檢測尿液中尿蛋白，血液中血脂、血糖、尿素氮和血清肌酐含量

實驗結(jié)束最后1 d，使用代謝籠收集尿液樣本，采用全自動生化分析儀測定尿白蛋白濃度；并用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中FBG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（serum creatinine，Scr）含量。

1.6 H-E染色觀察腎小球組織損傷

4%多聚甲醛溶液固定腎組織24 h 以上，用水和乙醇梯度洗脫，二甲苯脫醇，石蠟包埋。石蠟切片，二甲苯透明，乙醇和水梯度洗脫。然后經(jīng)脫蠟、蘇木精液染色、1% 鹽酸乙醇分化、0.6% 氨水返藍、0.5% 伊紅液染色后，再常規(guī)脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在400倍顯微鏡下觀察腎損傷情況。

1.7 TUNEL染色檢測腎組織細胞凋亡

4%多聚甲醛溶液固定的腎組織進行石蠟包埋、切片和脫水，然后與含有TdT 和生物素化dUTP的TUNEL 反應混合物37℃孵育1 h。在37℃的洗滌緩沖液中孵育30 min 終止反應。在E600 光學顯微鏡下（日本東京尼康）以×200倍的放大倍數(shù)在8個隨機場中計數(shù)TUNEL 陽性細胞的數(shù)量。

1.8 免疫印跡檢測

用RIPA裂解緩沖液在4℃下提取腎組織蛋白質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對等量蛋白質(zhì)（30 μg）進行電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）（Millipore）上。在TBST 溶解的5%脫脂牛奶中封閉1 h后，用稀釋的一 抗cas3（1∶500）、cleaved cas3（1：500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）、iNOS（1∶500）和IL-10（1∶500）4℃孵育過夜。然后，將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，并使用增強化學發(fā)光試劑ECL 顯示條帶，用ChemiDoc 圖像分析儀（中國上海天能）定量蛋白灰度值。

1.9 ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、iNOS和IL-6的水平

按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α、iNOS和IL-6 等炎性細胞因子的含量。

1.10 統(tǒng)計學處理

所有結(jié)果均以±s表示。使用SPSS 18.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，2組之間差異采用未配對t檢驗進行分析。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-146a-5p對DN模型大鼠生理生化指標的影響

結(jié)果顯示（表1、2），與正常對照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），血糖水平、飲水量及尿量明顯增加（P＜0.05），與糖尿病腎病患者癥狀符合，TG 和TC含量也顯著升高；與模型組相比，mimic 處理組大鼠體質(zhì)量有明顯增加，飲水量和尿量顯著減少（P＜0.05），F(xiàn)BG、TG 和TC含量也明顯降低（P＜0.05），mimic 對照組各指標沒有明顯變化。

表1 大鼠體質(zhì)量、飲水量和尿量指標測定（n=10，±s）

表1 大鼠體質(zhì)量、飲水量和尿量指標測定（n=10，±s）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 體質(zhì)量（g）飲水量（mL/24 h）尿量（mL/24 h）正常對照組 504.26±32.42 43.12±9.43 10.91±6.53模型組 363.18±48.23*236.34±39.71*106.34±29.21*Mimic 對照組 367.64±55.05 218.02±54.12 108.62±36.89 Mimic 處理組 448.93±40.84# 107.18±42.92# 41.83±12.07#

表2 大鼠空腹血糖、甘油三酯和膽固醇指標測定（n=10，±s，mmol/L）

表2 大鼠空腹血糖、甘油三酯和膽固醇指標測定（n=10，±s，mmol/L）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 FBG TG TC正常對照組 4.02±1.18 0.41±0.12 1.14±0.62模型組 19.64±5.21*0.75±0.15*1.92±0.40*Mimic 對照組 20.26±3.56 0.77±0.14 1.86±0.46 Mimic 處理組 10.04±1.29# 0.49±0.08# 1.47±0.30#

2.3 MiR-146a-5p可降低DN大鼠腎損傷標志物含量

結(jié)果顯示（表3），模型組大鼠尿蛋白、尿素氮和肌酐水平相較于正常對照組有明顯的升高（P＜0.05），而mimic 處理組能顯著下調(diào)模型組大鼠較高的尿蛋白、尿素氮和肌酐水平（P＜0.05）；mimic 對照組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義。

表3 尿白蛋白、血清尿素氮和肌酐的檢測（n=10，±s）

表3 尿白蛋白、血清尿素氮和肌酐的檢測（n=10，±s）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 尿蛋白（mg/L）BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）Control 7.19±2.51 5.02±0.34 51.44±8.25模型組 56.32±14.19*21.18±7.19*79.84±12.86*Mimic 對照組 54.78±11.93 20.52±5.66 82.33±11.21 Mimic 處理組 19.11±7.64# 10.64±3.46# 57.65±9.49#

2.4 MiR-146a-5p可減輕DN大鼠腎組織病變損傷

結(jié)果顯示（圖1），正常對照組大鼠腎小球形狀規(guī)則，細胞排列整齊、輪廓清晰，未觀察到炎性細胞的浸潤；糖尿病腎病大鼠腎小球體積增大，基底膜明顯擴張，伴有大量炎性細胞的浸潤；與模型組相比，mimic 對照組大鼠腎組織無變化，mimic處理組大鼠腎小球基底膜擴張、體積腫脹及炎性細胞的浸潤顯著減輕。

圖1 H-E染色觀察腎小球及周圍組織病變，×400，標尺=25 μm。圖中黑色箭頭為基底膜，紅色箭頭所指為炎癥細胞浸潤，圖B 較圖A基底膜增厚，出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤，圖D 較圖B 基底膜變薄，炎性細胞的浸潤減少。A：正常對照組；B：模型組；C：Mimic 對照組；D：Mimic 處理組.

2.5 MiR-146a-5p可抑制DN大鼠誘導的腎細胞凋亡

結(jié)果顯示（圖2），與正常對照組相比，糖尿病腎病大鼠腎組織中凋亡細胞數(shù)目（棕色）明顯增加，包括基底膜外側(cè)的足細胞，Bax/Bcl-2 比值和cleaved cas3表達顯著上調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，mimic 處理組凋亡細胞數(shù)目明顯減少，Bax/Bcl-2 比值和cleaved cas3表達顯著下調(diào)（P＜0.05），mimic 對照組無顯著變化。

圖2 各組大鼠腎組織凋亡變化，標尺=50 μm。A～D：TUNEL染色，×200，標尺=50 μm。A：正常對照組；B：模型組；C：Mimic 對照組；D：Mimic 處理組.E：cas3，Bax and Bcl-2 在腎組織的表達。*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組.

2.6 MiR-146a-5p可抑制DN大鼠誘導的炎癥反應

結(jié)果顯示（表4，圖3），與正常對照組相比，糖尿病腎病大鼠血清中炎癥細胞因子TNF-α、iNOS、IL-6和IL-10的水平顯著升高（P＜0.05），腎組織中iNOS和IL-10蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；mimic 處理組促炎因子TNF-α、iNOS和IL-6的水平顯著降低，抗炎因子IL-10的水平顯著升高（P＜0.05），腎組織中iNOS蛋白表達顯著下調(diào)，IL-10蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）；mimic 對照組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

表4 ELISA檢測大鼠血清中促炎因子的表達水平（n=10，±s，pg/mL）

表4 ELISA檢測大鼠血清中促炎因子的表達水平（n=10，±s，pg/mL）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 TNF-α iNOS IL-6正常對照組 15.27±4.38 22.08±6.39 15.23±5.37模型組 134.85±35.23*208.12±31.45*86.58±17.43*Mimic 對照組 138.78±29.61 213.48±38.54 93.63±11.26 Mimic 處理組 65.49±16.57# 81.03±19.42# 42.13±9.28#

3 討論

DN 是糖尿病的重要并發(fā)癥，其特征是蛋白尿、高血壓、水腫和腎功能不全[13]，具有多種致病因素和有限的治療方案。因此，探討DN的發(fā)病機制對DN的預防具有重要意義。糖脂代謝紊亂、炎癥因子異常表達和足細胞凋亡被認為是DN的致病因素[14]。STZ誘導的DN大鼠模型已被廣泛應用于DN 發(fā)病機制的研究[15]。DN 主要影響腎小球，因此腎小球濾過功能障礙導致的蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平升高作為評估腎功能損害的重要參考指標[16-17]。本研究結(jié)果顯示，HFD/STZ誘導的DN大鼠體質(zhì)量明顯下降，飲水量及尿量明顯增多，尿蛋白、血糖、血脂、血清肌酐和尿素氮水平顯著升高，表明DN大鼠腎功能損傷嚴重。MiR-146a-5p過表達可明顯改善大鼠體質(zhì)量及大鼠各項生化指標，表明miR-146a-5p 能明顯減輕STZ誘導的DN大鼠腎功能損傷。

研究表明DN的關(guān)鍵臨床標志物蛋白尿在miR-146a-/-糖尿病小鼠中顯著增加，且miR-146a的缺失導致腎小球面積明顯增大[18]，證明miR-146a 在DN的發(fā)展過程中起到保護作用。Lee 等[19]研究表明足細胞中miR-146a 缺失增加了糖尿病腎小球病變的風險。本研究結(jié)果顯示STZ誘導的DN大鼠腎小球體積增大，基底膜明顯擴張，并伴有大量炎性細胞的浸潤，miR-146a-5p過表達可顯著改善腎小球損傷，因此miR-146a-5p 在DN 發(fā)展過程中起到負調(diào)控作用。

足細胞的損傷和功能障礙是腎小球疾病的標志[20]。MiR-146a 在足細胞中高度表達[21]，表明它在維持足細胞健康中具有重要作用。MiR-146a表達水平在2型糖尿?。═2D）患者的腎小球中降低，這與白蛋白尿和腎小球損害增加有關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示miR-146a-5p過表達可明顯逆轉(zhuǎn)DN大鼠造成的腎小球細胞凋亡增加，Bax/Bcl-2 比值和cleaved cas3表達上調(diào)。因此miR-146a-5p可通過抑制細胞凋亡阻止DN的發(fā)展。

炎癥被認為是DN 病理生理的重要起因，某些細胞因子，例如核因子-κB（NF-κB）、IL-6和TNF-α 在炎癥反應中起著至關(guān)重要的作用[22]。IL-6和TNF-α 均可促進巨噬細胞活化，并誘導腎小球膜細胞增殖[23]。研究表明miR-146 可抑制NF-κB 信號通路，降低TNF-α、IL-1β 和IL-6的水平，對腎損傷起到保護作用[24]。本研究結(jié)果顯示，miR-146a-5p過表達可明顯上調(diào)抗炎因子IL-10的表達，下調(diào)促炎因子TNF-α、iNOS和IL-6的表達。因此miR-146a-5p通過抑制炎癥反應阻止DN的進展。

綜上，本研究結(jié)果表明miR-146a-5p可通過降低HFD/STZ誘導的DN大鼠一系列生理生化指標，改善腎小球濾過功能，抑制腎細胞凋亡及炎癥反應對腎損傷起到保護作用?？偠灾?，本研究結(jié)果提示miR-146a 在DN的發(fā)病機制中以及作為疾病進展的生物標志物方面具有新的作用。