羅布麻顆粒對(duì)化療型卵巢早衰大鼠Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

周 知 黎業(yè)娟 陳 琳 王安國(guó) 阮海玲 馬 寧 周 璟 涂志華

（海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心，生殖醫(yī)學(xué)中心，海口 570206）

卵巢早衰指由于卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）之外的各種原因而導(dǎo)致的女性持續(xù)性閉經(jīng)[1-4]。癌癥（腫瘤）患者接受化療藥物治療容易引起機(jī)體免疫力低下，可導(dǎo)致機(jī)體生殖系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷，引起卵巢早衰?；熜該p傷已成為女性生殖疾病的重要原因[5-6]。細(xì)胞凋亡在卵泡發(fā)育中起著重要作用，主要表現(xiàn)在卵子的產(chǎn)生、卵母細(xì)胞的變性、卵泡的選擇甚至卵泡的閉鎖等方面。卵巢早衰患者細(xì)胞凋亡可能失調(diào)。基于卵泡顆粒細(xì)胞是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要生理過(guò)程，其凋亡過(guò)程與Bcl-2家族相關(guān)。卵巢早衰大鼠卵巢內(nèi)存在大量小卵泡，由于下丘腦-垂體-卵巢軸功能紊亂，可能存在卵泡選擇或卵泡閉鎖等卵巢功能失調(diào)，缺乏成熟卵泡。本研究主要觀察化療藥物引起的卵巢早衰大鼠血清中Bcl-2、Bax蛋白的水平及其在卵巢組織中的表達(dá)水平的變化，并進(jìn)一步探討化療引起的卵巢早衰大鼠的卵巢形態(tài)變化和性激素水平異常與血清和卵巢組織中Bcl-2、Bax蛋白之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 模型制備與分組

選用SPF級(jí)2月齡左右的性成熟雌性SD大鼠120只，體質(zhì)量為245～265 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后，隨機(jī)分為對(duì)照組（20只）和造模組（100只）。按照Li 等[8]方法每天于下午4∶00、將順鉑（1.5 mg/kg）稀釋于1 mL 生理鹽水進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)10 d，制備卵巢早衰模型，在室溫下飼養(yǎng)。對(duì)照組放置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)。每周對(duì)大鼠進(jìn)行陰道涂片實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測(cè)大鼠動(dòng)情周期，觀察大鼠的一般情況變化（主要根據(jù)生物行為學(xué)）及大鼠發(fā)情周期的變化。使用毛細(xì)管從大鼠的眼眶靜脈叢取血，離心后取上層血清，放射免疫測(cè)定法測(cè)定各組大鼠血清中雌二醇（estradiol，E2）、FSH 和LH含量。將模型組中大鼠的激素含量與正常對(duì)照組進(jìn)行比較，根據(jù)以上激素水平、大鼠動(dòng)情周期及生物行為學(xué)的變化篩選出卵巢早衰的大鼠，并將它們隨機(jī)分為卵巢早衰模型組，羅布麻顆粒高、中、低劑量治療組（由于化療藥物藥性強(qiáng)，27只大鼠在造模過(guò)程中死亡，剩余73只大鼠用于后期的實(shí)驗(yàn)），高、中、低劑量為按照成人劑量與大鼠劑量關(guān)系換算分別為46.86、23.43、11.72 mL/kg，其中高劑量組與中劑量組分早晚2次灌胃。每3 d 進(jìn)行藥物治療1次，時(shí)間為2周。給藥結(jié)束后將所有大鼠麻醉，隨后腹主動(dòng)脈取血，分離血清備用；取兩側(cè)卵巢，一側(cè)用于H-E染色，一側(cè)用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 H-E染色

大鼠卵巢組織經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、烘干等處理，備做H-E染色。

1.3 ELISA檢測(cè)

嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書要求，測(cè)定大鼠血清E2、FSH、LH水平及Bcl-2、Bax的含量，在酶標(biāo)儀上450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔吸光度（OD）值。

1.4 免疫組織化學(xué)顯色

切片脫蠟，抗原修復(fù)，加稀釋好的Bcl-2、Bax抗體（Bcl-2為1∶200，Bax為1∶100），加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，顯色劑顯色，自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察染色結(jié)果。卵巢組織標(biāo)本中細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色或黃色顆粒狀著色為陽(yáng)性表達(dá)。采用IPP 6.0 軟件在同等條件下檢測(cè)每張組織切片中的Bcl-2、Bax表達(dá)的積分光密度（IOD）值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠卵巢卵泡發(fā)生情況

卵巢早衰模型組大鼠中，未見明顯的初級(jí)卵泡，原始的卵泡幾乎沒(méi)有，閉鎖卵泡增多，說(shuō)明卵巢水腫嚴(yán)重；羅布麻顆粒高劑量治療組大鼠可見初級(jí)卵泡，閉鎖卵泡較卵巢早衰模型組減少（圖1，見封二）。

2.2 大鼠血清中E2、FSH、LH、Bcl-2、Bax的變化

與對(duì)照組比較，卵巢早衰模型組大鼠血清中E2 及Bcl-2含量降低（P＜0.05），F(xiàn)SH、LH、Bax的含量升高（P＜0.05）；各藥物治療組與卵巢早衰模型組比較，E2、Bcl-2含量升高，F(xiàn)SH、LH、Bax的含量降低（P＜0.05）（表1）。

2.3 大鼠卵巢Bax 和Bcl-2蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示（圖2，見封二），Bax蛋白主要在對(duì)照組大鼠卵巢顆粒層細(xì)胞中表達(dá)，黃體中少量表達(dá)（3.92±0.49）；在卵巢早衰模型組大鼠卵巢顆粒層細(xì)胞、黃體及間質(zhì)中高度表達(dá)（10.21±0.85）；經(jīng)過(guò)羅布麻顆粒治療后，Bax蛋白在各組卵巢中的表達(dá)呈不同程度下降趨勢(shì)，其中羅布麻顆粒高劑量治療組（7.12±0.59）相對(duì)于中劑量治療組（7.92±0.62）、低劑量治療組（8.89±0.75），治療效果最為顯著。Bcl-2蛋白主要在對(duì)照組大鼠卵巢顆粒層細(xì)胞中表達(dá)（6.73±0.52）；在卵巢早衰模型組大鼠卵巢顆粒層細(xì)胞、黃體及間質(zhì)中低表達(dá)（3.14±0.79），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），且Bcl-2/Bax比值明顯下降（P＜0.05）。與卵巢早衰模型組比較，羅布麻顆粒高劑量治療組（6.43±0.73）、中劑量治療組（5.14±1.07）、低劑量治療組（3.98±1.36）大鼠卵巢Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），且Bcl-2/Bax比值明顯上升（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠卵巢卵泡發(fā)生情況，H-E染色，×100。A：對(duì)照組；B：卵巢早衰模型組；C：羅布麻顆粒高劑量治療組；D：羅布麻顆粒中劑量治療組；E：羅布麻顆粒低劑量治療組.

圖2 各組大鼠卵巢組織Bax（A1～E1）和Bcl-2（A2～E2）的表達(dá)，×200。A1、A2：對(duì)照組；B1、B2：卵巢早衰模型組；C1、C2：羅布麻顆粒高劑量治療組；D1、D2：羅布麻顆粒中劑量治療組；E1、E2：羅布麻顆粒低劑量治療組.

表1 各組大鼠血清中E2、FSH、LH、Bcl-2、Bax含量的變化（±s）

表1 各組大鼠血清中E2、FSH、LH、Bcl-2、Bax含量的變化（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs 對(duì)照組；#P＜0.05vs 卵巢早衰模型組

組別 n E2（pg/mL）FSH（mlU/mL）LH（mlU/mL）Bcl-2（pg/mL）Bax（mlU/mL）對(duì)照組 18 49.17±5.87 2.34±0.67 3.72±1.13 49.17±5.87 2.34±0.67卵巢早衰模型組 18 21.09±7.80** 8.57±0.89** 8.84±1.51** 21.09±7.80*8.57±0.89*高劑量治療組 17 38.81±6.11# 4.14±0.35# 4.75±0.45# 38.81±6.11# 4.34±0.76#中劑量治療組 19 33.97±5.56 4.89±0.35# 5.45±0.87# 33.97±5.56# 5.94±0.35低劑量治療組 19 31.97±4.63 5.34±0.76 5.82±1.17 31.14±4.35 7.11±0.35

3 討論

現(xiàn)實(shí)生活中造成卵巢早衰的病因眾多，涉及激素水平異常、免疫因素、化療藥物、環(huán)境因素和各種不明原因等，目前很多的學(xué)者認(rèn)為卵巢早衰是可能具有高度特異性、遺傳和環(huán)境相互交叉作用的多因素疾病[7-8]。本課題組對(duì)于化療型卵巢早衰的治療采用中藥羅布麻顆粒進(jìn)行治療。羅布麻包含肉桂、苜蓿子、韭菜子、大葉補(bǔ)血草、蒺藜、紫茉莉根、肉豆蔻衣、肉豆蔻、白皮松子、芝麻菜子、西紅花等藥物成分[9-10]。羅布麻在臨床上主要用于治療免疫力低下、體虛、消瘦、神經(jīng)衰弱等，具有溫補(bǔ)腦腎、益心填精的功效，對(duì)調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫力也有較好的功效。

化療型卵巢損傷是一種嚴(yán)重女性生殖疾病，目前缺乏有效的治療方法。由于化療型卵巢早衰越來(lái)越普遍，因此迫切需要尋找新的治療方法。本研究中，順鉑誘導(dǎo)化療型卵巢損傷后，卵巢儲(chǔ)備功能明顯下降，卵巢細(xì)胞的凋亡加快，導(dǎo)致卵池中初級(jí)卵母細(xì)胞減少，卵巢功能衰竭，從而造成卵巢3早衰[11]。

本研究探討了凋亡信號(hào)通路中Bcl-2家族成員對(duì)卵巢細(xì)胞凋亡的影響。Bcl-2家族能對(duì)細(xì)胞表面或內(nèi)部的死亡信號(hào)作出反應(yīng)，并影響凋亡小體的形成和caspase級(jí)聯(lián)的激活，促進(jìn)Bcl-2 及Bax的過(guò)表達(dá)，加快卵巢細(xì)胞凋亡，即Bax 和Bcl-2 起著“變阻器”的作用[12-13]。本研究結(jié)果提示Bax 和Bcl-2蛋白參與了卵巢濾泡顆粒細(xì)胞的凋亡。卵巢早衰大鼠濾泡顆粒細(xì)胞凋亡增加，尤其是竇性濾泡，羅布麻顆粒治療可減緩卵巢濾泡顆粒細(xì)胞凋亡，升高Bcl-2 在血清中的含量，進(jìn)一步阻止卵泡閉鎖的發(fā)生發(fā)展，從而進(jìn)入竇性卵泡的募集。

化療隨之帶來(lái)的是身體內(nèi)分泌的紊亂及其他組織器官的損傷，尤其是生殖系統(tǒng)損傷最為嚴(yán)重，造成機(jī)體免疫力低下[14]。本研究通過(guò)順鉑建立化療藥物致卵巢早衰大鼠模型，在此基礎(chǔ)上觀察研究羅布麻顆粒對(duì)卵巢早衰模型大鼠血清性激素水平以及卵巢形態(tài)的影響。結(jié)果顯示，Bcl-2、Bax蛋白主要在正常大鼠卵巢顆粒層細(xì)胞中表達(dá)，黃體中少量表達(dá)，Bcl-2、Bax蛋白在模型組中大鼠顆粒層細(xì)胞、黃體及間質(zhì)中高度表達(dá)，Bcl-2/Bax比值較明顯下降，提示卵巢Bax蛋白上調(diào)，Bcl-2蛋白下調(diào)可能加快大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致大鼠卵泡閉鎖以及水腫，引起卵巢早衰。與卵巢早衰模型組比較，羅布麻顆粒高、中、低劑量治療組大鼠卵巢Bax蛋白表達(dá)減少，且Bcl-2/Bax 明顯上升，提示不同劑量的羅布麻顆粒能夠增加Bcl-2蛋白在卵巢組織中的表達(dá)，減少Bax蛋白在卵巢組織中的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比例升高，從而抑制卵巢顆粒細(xì)胞的過(guò)度凋亡，減少卵泡閉鎖，改善卵巢功能，抑制卵巢的進(jìn)一步衰退。