結(jié)直腸癌患者血清組織蛋白酶B與IL-22、IL-17水平的相關(guān)分析*

蘭巧芬,耿有全,張?jiān)婎?陳 娟,陳喜霞,張惠冰

福建中醫(yī)'藥大學(xué)附屬福鼎市醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福鼎 355200

結(jié)直腸癌(CRC)是常發(fā)生于結(jié)腸或直腸部位的惡性上皮性腫瘤。多年來(lái)該病的發(fā)病率和病死率一直居高不下，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生命[1]。近十幾年來(lái)，直腸癌的發(fā)病機(jī)制研究一直都是一個(gè)熱門(mén)話(huà)題，也是一個(gè)世界難題。隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，人們從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平及它們之間的信號(hào)通路方面和T淋巴細(xì)胞等方面對(duì)CRC進(jìn)行了大量研究。既往研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中組織蛋白酶B(CB)在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。免疫方面，免疫細(xì)胞一直以來(lái)也是CRC發(fā)病機(jī)制研究的主要對(duì)象，但主要集中在T淋巴細(xì)胞，如Th17和Th22細(xì)胞。CB能夠促進(jìn)細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素(IL)-23、IL-1β及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]的產(chǎn)生，而這些細(xì)胞因子正是Th17及Th22細(xì)胞分化所需物質(zhì)[2-3]。

因此本研究擬探討不同時(shí)期的CRC患者中CB水平與IL-17、IL-22水平的關(guān)系，進(jìn)一步了解在CRC患者外周血中CB能否作為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的早期診斷的一個(gè)指標(biāo)，這將有助于深入明確CRC新的發(fā)病機(jī)制，并為新的干預(yù)治療策略提供線(xiàn)索。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年6月至2019年1月在福鼎市醫(yī)院外科行CRC切除及腫瘤科明確診斷為CRC的患者82例作為CRC組。所有患者術(shù)前未進(jìn)行放化療，無(wú)感染性疾病，近期無(wú)服用免疫抑制劑病史，術(shù)后病理證實(shí)為結(jié)腸或直腸腺癌，原發(fā)灶不能切除者被排除。82例CRC患者中男45例，女37例；平均年齡(61±2)歲；按Dukes分期法分為A～B (Ⅰ～Ⅱ)期30例(低分化腺癌10例、高中分化腺癌20例)，C～D(Ⅲ～Ⅳ)期52例(低分化腺癌25例、高中分化腺癌27例)。選擇30例健康志愿者為健康對(duì)照組，其中男15例，女15例；平均年齡(61±2)歲。本研究獲得所有受試者本人同意及本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2試劑及儀器 人CB ELISA試劑盒由上海復(fù)星生物工程公司提供，人IL-17和IL-22 ELISA試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供；采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.3方法 采集所有研究對(duì)象外周靜脈血不少于4 mL，室溫血液自然凝固10～20 min，3 500 r/min離心10 min左右。仔細(xì)收集上清液，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。應(yīng)用雙抗體夾心法(ELISA法)按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定標(biāo)本中CB、IL-17和IL-22水平，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定，在450 nm處讀取吸光度(A)值，測(cè)定值按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算成CB、IL-17和IL-22水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清CB水平比較 CRC組患者血清CB水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)。且隨著病情發(fā)展，Ⅲ～Ⅳ期的CRC患者血清CB水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P<0.05)，中高分化的CRC患者血清CB水平明顯低于低分化的患者(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：*P<0.05;**P<0.01。

2.2兩組研究對(duì)象血清IL-22、IL-17水平比較 CRC組患者血清IL-17、IL-22水平均明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且隨著病情發(fā)展，Ⅲ～Ⅳ期的CRC患者血清IL-17、IL-22水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，中高分化的CRC患者血清IL-17、IL-22水平明顯低于低分化的患者(P<0.05)，而中高分化的CRC患者血清IL-17、IL-22水平與健康對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Ⅰ～Ⅱ期CRC患者血清IL-22水平與健康對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、3。

注：*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

注：*P<0.05;**P<0.01。

2.3CRC患者血清中CB水平與IL-22及IL-17水平的相關(guān)性 CRC患者血清CB水平與血清IL-22水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.835 1,P<0.001)；CRC患者血清CB水平與血清IL-17水平也是呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.955 1,P<0.001)，見(jiàn)圖4。

注：A表示CB水平與IL-17水平的相關(guān)性分析；B表示CB水平與IL-22水平的相關(guān)性分析。

3 討 論

組織蛋白酶屬于溶酶體半胱氨酸蛋白酶中的番木瓜蛋白酶超家族，有11種(B、C、F、H、L、K、O、S、V、W、X)，不同的組織蛋白酶在腫瘤的發(fā)展中起著不同的作用，比如在腫瘤中發(fā)揮增殖、血管再生、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)等作用[4]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，CB在腫瘤時(shí)期表達(dá)明顯增高,在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用，它能夠降解基底膜、細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)締組織，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。本研究顯示CRC患者血清中的CB水平是高于健康者的，且隨著腫瘤發(fā)展，Ⅲ～Ⅳ期CRC患者血清CB水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，隨著腫瘤的分化程度增高而逐漸減低，與文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道的癌胚抗原(CEA)、糖類(lèi)抗原199(CA199)水平與疾病發(fā)展和分化程度呈負(fù)相關(guān)相似，可更進(jìn)一步有效反映CRC患者腫瘤細(xì)胞分化程度，對(duì)病情評(píng)估、對(duì)癥治療具有重要指導(dǎo)意義。

CRC發(fā)生、發(fā)展的最主要致病因素是腸內(nèi)慢性炎癥[7]，其中炎癥細(xì)胞(CD4+T淋巴細(xì)胞等)及炎癥因子是這一過(guò)程的重要參與者。越來(lái)越多的證據(jù)也說(shuō)明了CD4+T淋巴細(xì)胞各亞群之間的平衡和它們的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是影響CRC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[8-9]，其中IL-17和IL-22與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。IL-17 是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的促炎癥細(xì)胞因子。研究表明，在胃癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞肝癌及 CRC 等惡性腫瘤中，IL-17 均呈高表達(dá)[11]。 IL-22 是 Th22 細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，其可能通過(guò) STATA3 信號(hào)通路機(jī)制抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)結(jié)腸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，IL-22 在潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸癌中高表達(dá)與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]。在免疫方面，Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞都是由初始 CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)共刺激信號(hào)活化后，在不同因子的刺激下分別分化而來(lái)。Th17 是在 TGF-β、IL-1β、IL-23和 IL-6 的誘導(dǎo)下由初始 CD4+T淋巴細(xì)胞分化而來(lái)的，Th22是在TNF-α及IL-6的誘導(dǎo)下由初始 CD4+T淋巴細(xì)胞分化而來(lái)的。Th17和Th22都可分泌眾多細(xì)胞因子，其中最具特征性的分別是IL-17和IL-22。近年研究發(fā)現(xiàn)CB可促進(jìn)IL-1β、IL-23及TNF-α的產(chǎn)生[13]。SON等[14]提出，CB在Caspase-1成熟及促進(jìn)炎癥因子產(chǎn)生中扮演重要角色。那么，在CRC患者中，血清IL-17及IL-22高水平表達(dá)，且隨著腫瘤發(fā)展，在Ⅲ～Ⅳ期的水平高于Ⅰ～Ⅱ期，隨著腫瘤的分化程度增高而逐漸減低，CB水平與IL-22、IL-17水平呈正相關(guān)，因此本試驗(yàn)可初步探討CB可能通過(guò)促進(jìn)分泌細(xì)胞因子而誘導(dǎo)Th17及Th22細(xì)胞分化，促進(jìn)CRC進(jìn)展，具體的機(jī)制可通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)及其他角度進(jìn)一步探討。

綜上所述，CRC患者血清CB、IL-17、IL-22水平隨疾病進(jìn)展均明顯升高，隨腫瘤分化程度增高而減低，且CB水平與IL-17、IL-22水平呈顯著正相關(guān)，這將為CRC轉(zhuǎn)移的早期診斷及防治提供新的線(xiàn)索。