長(zhǎng)鏈非編碼RNA MEG3對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響

許 睿，錢(qián) 軍，張明亮，張立功，郭晨旭，謝 強(qiáng)

（蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科-中德乳腺VIP病區(qū)，安徽 蚌埠 233000）

最新調(diào)查顯示，乳腺癌的發(fā)病率在女性癌癥中逐年上升，成為世界上最常見(jiàn)的癌癥之一［1］。雖然近年來(lái)乳腺癌患者的總體生存和預(yù)后有所改善，但轉(zhuǎn)移仍是患者死亡的首要原因。乳腺癌轉(zhuǎn)移患者5年生存率僅26%，而非轉(zhuǎn)移患者通過(guò)治療后總生存率可以達(dá)到90%［2-3］。因此，確定乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)成為乳腺癌治療的必要途徑。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一組長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA［4］。在最近的研究中證實(shí)，lncRNA 在基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮著極其重要的作用，并參與了腫瘤的形成、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性等［5］。LncRNA MEG3 定位于人類(lèi)染色體14q32，屬于DLK1-MEG3 基因座［6］。最近幾年引起了人們的廣泛關(guān)注，已有學(xué)者表明lncRNA MEG3可作為抑癌基因調(diào)控癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［7］，但在侵襲和遷移方面的機(jī)制并無(wú)具體研究。因此，本研究主要在細(xì)胞水平上通過(guò)在乳腺癌細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)lncRNA MEG3，檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變，并探討其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7、SKBR-3 均由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供；pcDNA3.1-vector和pcDNA3.1-MEG3由上海吉?jiǎng)P基因公司合成；RPMI-1640 培養(yǎng)基及胎牛血清由美國(guó)Gibco 公 司 提 供；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn) 染 試 劑、TRIzol?Plus RNA Purification Kit 和Revert Aid First Strand cDNA short kit 由美國(guó)Invitrogen 公司生產(chǎn)；Power SYBR?Green PCR Master Mix 由瑞士Roche 公司提供；兔抗人E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 及β-actin 單克隆抗體及鼠抗兔IgG 二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；結(jié)晶紫溶液及BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒由上海碧云天公司生產(chǎn)；Transwell 小室購(gòu)于美國(guó)Corning 公 司；matrigel 基 質(zhì)膠 由 美 國(guó)Sigma 公 司 生產(chǎn)；LncRNA MEG3 引物序列由上海吉?jiǎng)P基因提供，引 物 序 列 如 下 ： MEG3-F： 5'-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3'，MEG3-R：5'-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3'miRNA-21-F：5'-TTTTGTTTTTGCTGGTCTTAG-3'；miRNA-21-R：5'-AGCAGACAGTCAGGCAGGAT-3'；GAPDH-F：5'-TGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3'，GAPDH-R：5'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。

1.2 乳腺癌細(xì)胞株RNA 提取及qRT-PCR 反應(yīng)取相應(yīng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞株，通過(guò)Trizol?氯仿?異丙醇法提取總RNA，繼而逆轉(zhuǎn)錄成合成cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算LncRNA MEG3的表達(dá)量。反應(yīng)條件：①變性95 ℃25 s；②退火60 ℃25 s；③延伸72 ℃30 s。共40個(gè)循環(huán)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株由10%胎牛血清及1%青鏈霉素溶液配置成的RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取適量細(xì)胞接種于六孔板中，按10 μL的Lipo2000?混合4 μg質(zhì)粒置入500 μL不含血清的培養(yǎng)基中，細(xì)胞培養(yǎng)6 h 后更換不含雙抗的10%胎牛血清培養(yǎng)基，48 h后繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 Western blot 檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)變化取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞，加入裂解液，提取總蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。以每孔15～20 μg 總蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶封閉2 h，T-TBS漂洗。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin（英國(guó)Abcam 公司；ab231303，ab76011，ab16700）一抗以1∶1 000稀釋?zhuān)?actin一抗以1∶2 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。二抗以1∶5 000稀釋?zhuān)覝負(fù)u床孵育1 h，T-TBS 漂洗，ECL 顯色。以β-actin（英國(guó)Abcam；ab6276）為內(nèi)參，用Image J 分析目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值來(lái)計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)/孔接種于六孔板中。待細(xì)胞鋪滿(mǎn)板底后，使用10 μL體積的移液器吸頭在板底中心進(jìn)行筆直刮擦。用PBS（磷酸鹽緩沖鹽溶液，HyClone，美國(guó)）洗滌后，添加無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h后進(jìn)行顯微鏡觀(guān)察和成像。

1.6 Transwell 實(shí)驗(yàn)提前24 h 配置matrigel 基質(zhì)膠，均勻鋪于transwell 小室底部。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后，將每組細(xì)胞懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中，配置成2×105個(gè)·mL-1細(xì)胞濃度，取200 μL位于上室，將完全培養(yǎng)基（700 μL）置于下室，培養(yǎng)24 h。然后用甲醇處理20 min，結(jié)晶紫染色。最后，使用倒置顯微鏡任意捕獲5個(gè)視野，在20倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0 及Graph Prism 7.0 軟件進(jìn)行分析及統(tǒng)計(jì)繪圖，配對(duì)t檢驗(yàn)用于兩組間比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR 檢測(cè)三種乳腺癌細(xì)胞株LncRNA MEG3 表達(dá)水平通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)得出，三種乳腺癌細(xì)胞株中，MCF-7細(xì)胞中LncRNA MEG3（0.49±0.037）表達(dá)水平較MDA-MB-231（0.92±0.049）與SKBR-3（0.67±0.023）表達(dá)更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此選取細(xì)胞株MCF-7 進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 qRT?PCR檢測(cè)三種乳腺癌細(xì)胞中LncRNA MEG3基因相對(duì)表達(dá)水平（P＜0.05）

2.2 qRT-PCR 驗(yàn) 證pcDNA3.1-MEG3 重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染效率通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)得出，經(jīng)過(guò)pcDNA3.1-MEG3 轉(zhuǎn)染的MCF-7 乳腺癌細(xì)胞株（12.7±0.750）與轉(zhuǎn)染空載體（1.19±0.096）和未轉(zhuǎn)染（1.3±0.202）的細(xì)胞株相比，LncRNA MEG3 表達(dá)水平升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞中miRNA-21 的表達(dá)量變化通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)得出，經(jīng)過(guò)pcDNA3.1-MEG3轉(zhuǎn)染的MCF-7乳腺癌細(xì)胞（2.947±0.436 3）與轉(zhuǎn)染空載體（5.663±0.331 9）和未轉(zhuǎn)染（6.617±0.291 6）的細(xì)胞株相比，miRNA-21的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖2 轉(zhuǎn)染后檢測(cè)LncRNA MEG3在MCF?7細(xì)胞中表達(dá)水平（P＜0.05）

圖3 LncRNA MEG3 過(guò)表達(dá)抑制MCF?7 細(xì)胞miRNA?21 的表達(dá)量（P＜0.05）

2.4 LncRNA MEG3 過(guò)表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 遷移劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移率為（17.6±1.323），而轉(zhuǎn)染空載體組與未轉(zhuǎn)染組遷移率分別為（35.7±1.572）與（31.27±2.085），過(guò)表達(dá)組遷移率低于空載體與未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)抑制MCF?7細(xì)胞遷移能力

2.5 LncRNA MEG3 過(guò)表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7 侵襲Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞穿膜率為（40.73±4.087），而轉(zhuǎn)染空載體組與未轉(zhuǎn)染組遷移率分別為（72.12±1.898）與（71.67±1.846），過(guò)表達(dá)組侵襲能力低于空載體與未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.6 LncRNA MEG3 影響MCF-7 乳腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于空載體組與未轉(zhuǎn)染組，過(guò)表達(dá)組中E-Cadherin相對(duì)表達(dá)量升高，而N-Cadherin 與Vimentin 相對(duì)表達(dá)量則降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖5 LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)抑制MCF?7細(xì)胞侵襲能力

圖6 LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)的MCF?7細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的變化情況

3 討 論

乳腺癌是全世界婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌發(fā)生率及死亡率逐年上升，并呈年輕化發(fā)展趨勢(shì)［8］。乳腺癌的根本治療手段為手術(shù)治療，但手術(shù)治療對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移患者的治療效果并不理想。所以乳腺癌患者的早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療對(duì)于病情的控制非常重要。因此，尋找乳腺癌相關(guān)標(biāo)志物及獲取相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)對(duì)于早期的癌癥篩查工作具有重要意義。

已有研究證實(shí)，LncRNA在基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮著極其重要的作用，WANG 的研究表明lncRNA SNHG7 促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制胃癌細(xì)胞凋亡［9］。ZHANG 等發(fā)現(xiàn)lncRNA Linp1 在人類(lèi)三陰性乳腺癌中被過(guò)度表達(dá)，并加強(qiáng)細(xì)胞DNA 的修復(fù)［10］。這些研究表明，LncRNA 可能成為惡性腫瘤早期診斷篩查的特異性標(biāo)志物。且最新研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MEG3可通過(guò)多種機(jī)制參與細(xì)胞蛋白表達(dá)的調(diào)控，DAN 等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-MEG3 在胃癌中通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA-21 抑制增殖和轉(zhuǎn)移［11］。LING 等學(xué)者指出LncRNA-MEG3 抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并以miR-93 為靶點(diǎn)，抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路［12］。但LncRNA-MEG3在乳腺癌中的作用尚不清楚，本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)MCF-7細(xì)胞中LncRNA-MEG3，檢測(cè)MCF-7細(xì)胞侵襲及遷移的變化情況，并聯(lián)系EMT 相關(guān)蛋白變化情況，探討相關(guān)機(jī)制研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)pcDNA3.1-MEG3 重組質(zhì)粒成功過(guò)表達(dá)MCF-7 細(xì)胞中LncRNA-MEG3，并通過(guò)qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)miRNA-21 的表達(dá)明顯受到抑制。我們采用劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)了MCF-7 細(xì)胞遷移及侵襲能力的改變情況，發(fā)現(xiàn)LncRNA-MEG3 能夠有效的抑制MCF-7 細(xì)胞的遷移及侵襲能力。并通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況，過(guò)表達(dá)后的MCF-7細(xì)胞E-Cadherin蛋白表達(dá)量上調(diào)而N-Cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)量下調(diào)。

綜上所述，LncRNA-MEG3 的表達(dá)能夠調(diào)控miRNA-21的表達(dá)變化，進(jìn)而改變?nèi)橄侔┘?xì)胞MCF-7侵襲及遷移能力，且LncRNA-MEG3 表達(dá)水平越高，miRNA-21 表達(dá)水平越低，細(xì)胞侵襲及遷移能力就越弱，且這種調(diào)節(jié)機(jī)制可能與EMT 相關(guān)蛋白調(diào)控有關(guān)。但本文只是對(duì)細(xì)胞學(xué)方面做了一部分探討，沒(méi)有真正調(diào)查臨床患者的實(shí)際情況，存在一定的局限性，下一步準(zhǔn)備收集病患資料，研究LncRNA-MEG3 是否會(huì)影響患者生存率?？傊?，本研究是首次報(bào)道LncRNA-MEG3 與乳腺癌細(xì)胞之間的相關(guān)性，我們希望能夠作為一個(gè)新的思路運(yùn)用到乳腺癌的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)及靶向治療當(dāng)中去。