辛伐他汀減輕放射性肺損傷的初步研究

王金鳳，王春麗，郭海亮，黃 莉，王祥財(cái)，葉建明

（贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江西 贛州 341000）

惡性腫瘤是全世界最嚴(yán)重的疾病之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康，而胸部腫瘤在惡性腫瘤中占很大比例，如肺癌、乳腺癌、食管癌、縱隔惡性腫瘤。放射治療是胸部惡性腫瘤的主要治療方法之一，但在放療過程中，正常肺組織不可避免地受到射線照射，導(dǎo)致急、慢性放射性肺損傷，放射性肺損傷主要包括早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纖維化，嚴(yán)重影響患者的治療療效。目前，尋找療效可靠、不良反應(yīng)小的放射防護(hù)劑仍是今后放射治療研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀除了降脂作用外［1］，還具有抗氧化、抗炎、減輕放射性皮炎及腸炎、減少唾液腺等作用［2-4］。本研究通過建立小鼠放射性肺損傷模型，觀察辛伐他汀對(duì)放射性肺損傷的防治作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用辛伐他汀防治放射性肺損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及主要儀器辛伐他?。⊿imvas?tatin）購自美國sigma 公司（純度≥98%）。轉(zhuǎn)化生長因子βl（TGF-β1）ELISA 試劑盒，腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA、羥脯氨酸（Hyp）測試盒（海門碧云天生物技術(shù)研究所），超氧化物歧化酶（SOD）、微量丙二醛（MDA）、HE 染液及Masson 染液試劑盒（南京建成生物工程研究所）。倒置顯微鏡（日本Olymbus公司，CKX41-C31BF），紫外分光光度計(jì)（南京五義科技有限公司，OD-1000+），酶標(biāo)儀（美國Bio Rad 公司，680），生物組織切片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，JJQ-P2016A），放射治療機(jī)器（美國瓦里安公司）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，雌性，12 周齡，4～6 只1 籠，飼料、飲水不限，在無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）級(jí)條件下飼養(yǎng)。

1.2 分組及動(dòng)物模型健康雌性C57BL/6 小鼠80只，體重為13～16 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2008-0010。小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（不照射，予生理鹽水0.3 mL/只）、單藥組（不照射，予辛伐他丁原液）、單放組（胸部照射）、聯(lián)合組（胸部照射+予辛伐他丁原液），每組20只。單放組和聯(lián)合組需行放射性肺損傷造模，將小鼠麻醉后仰臥固定在鼠板上，充分暴露其胸部，其余部位加以擋鉛，采用6Mv X射線照射全肺，源皮距100 cm，吸收劑量率2.6 Gy·min-1，總劑量為15 Gy。照射后4 h，單藥組和聯(lián)合組小鼠每天辛伐他汀10 mg·kg-1灌胃，單放組和空白組每天飼以0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)灌胃30 d。

1.3 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集及處理連續(xù)灌胃30 d 后，分別于照射后8 周、16 周、24 周3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每組隨機(jī)取5 只小鼠活體取材。腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉各組小鼠，將小鼠麻醉后，心腔取血，靜置于4 ℃冰箱1 h 后，4 ℃離心15 min，取上清液，－80 ℃保存。取血后，立即打開胸腔取肺組織，用4%多聚甲醛溶液固定，－80 ℃凍存?zhèn)溆?，右肺用于檢測MDA含量、SOD 活力及Hyp 含量，左肺固定于10%緩沖性甲醛液中，用常規(guī)法石蠟包埋，切片備用，經(jīng)HE染色和Masson染色后進(jìn)行光鏡觀察病理改變。

1.4 病理學(xué)觀察將凍存?zhèn)溆玫淖蠓谓M織用常規(guī)法石蠟包埋，切片，HE 染色及Masson 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 檢測指標(biāo)采用ELIAS 法檢測血清中TNF-α、TGF-β1及Hyp 的含量；采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行MDA含量、SOD活力測定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用one-way 方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況空白組和單藥組在試驗(yàn)期間，精神、進(jìn)食、體重等都表現(xiàn)正常。單放組小鼠照射后出現(xiàn)精神萎靡、進(jìn)食量減少、活動(dòng)遲緩、體重減輕；2 周后照射野內(nèi)皮毛脫落、變白，部分小鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快，至24 周照射野皮毛基本全部脫落。聯(lián)合組小鼠第3 d 后出現(xiàn)精神欠佳，3 周后精神逐漸改善，進(jìn)食量、活動(dòng)、體重變化均較單放組好，照射野內(nèi)僅少量皮毛脫落、變白。

2.2 病理組織學(xué)觀察HE 染色空白組和單藥組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡、肺泡壁及支氣管結(jié)構(gòu)正常，肺間質(zhì)無增厚及炎性細(xì)胞浸潤。單放組在照射后8 周可見明顯肺間質(zhì)充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤；第16周時(shí)炎癥輕度減輕，可見肺泡壁增厚，肺泡腔輕至中度變小；第24 周時(shí)肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增厚、進(jìn)行性纖維化，肺泡腔明顯萎陷變小。聯(lián)合組在照射后8周可見輕到中度急性炎癥改變；第16周可見炎癥明顯減輕，無明顯肺泡壁增厚，肺泡腔輕度變?。坏?4 周時(shí)炎癥明顯減輕，肺間質(zhì)增厚，肺組織結(jié)構(gòu)輕微破壞（圖1）。Masson 染色空白組和單藥組未見明顯肺纖維化，單放組小鼠肺組織第8 周即有少許放射性肺纖維化；第16 周放射性肺纖維化形成增多；第24周時(shí)顯著增多。聯(lián)合組在照射后各時(shí)間點(diǎn)與單放組比較肺纖維化程度均降低（圖2）。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，×100）

圖2 各組小鼠肺組織病理變化（Masson染色，×100）

2.3 小鼠肺組織羥自由基含量血清Hyp 含量可反映在自由基攻擊下引起受照射組織炎癥的嚴(yán)重程度。各時(shí)間點(diǎn)（8周、16周、24周）聯(lián)合組小鼠血清Hyp 含量低于單放組，但仍較空白組和單藥組有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和單藥組小鼠血清Hyp 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

2.4 小 鼠 血 清 中TNF-α、TGF-β1 的 表達(dá) 水 平放射線照射后，可引起體內(nèi)TNF-α、TGF-β1等炎性因子表達(dá)水平的升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，照射后TNF-α和TGF-β 各時(shí)相均升高，聯(lián)合組TNF-α 和TGF-β1略高于空白組和單藥組，均比單放組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白組和單藥組相比差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表1 照射后各時(shí)間點(diǎn)小鼠肺Hyp含量/μg·g?1

2.5 小鼠肺組織MDA 含量變化聯(lián)合組小鼠肺組織MDA 含量，各時(shí)間點(diǎn)均略高于空白組和單藥組，但與單放組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白組和單藥組的MDA 含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

2.6 小鼠肺組織SOD 活性變化聯(lián)合組小鼠肺組織SOD 活性，各時(shí)間點(diǎn)均略低于空白組和單藥組，但與單放組相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），空白組和單藥組的SOD 活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表2 照射后各時(shí)間點(diǎn)各組小鼠血清TGF?β1、TNF?α/ng·mL?1

表3 照射后各時(shí)間點(diǎn)各組小鼠肺組織SOD活性、MDA含量

3 討 論

胸部腫瘤在放射治療中最常見的并發(fā)癥是放射性肺損傷，其包括放射性肺炎和放射性肺纖維化。隨照射時(shí)間延長放射性肺損傷逐漸加重，肺泡的病理變化為肺充血、水腫、肺間質(zhì)增厚及肺泡腔萎陷變小，后期出現(xiàn)肺泡間隔進(jìn)行性纖維化的特征性損傷。本實(shí)驗(yàn)研究表明，通過HE 染色和Masson染色證實(shí)放射性肺損傷的病理改變是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，聯(lián)合組與單放組比較放射性肺炎炎癥反應(yīng)及肺纖維化程度均明顯降低，表明辛伐他汀可緩解小鼠放射性肺損傷。

放射性肺炎多發(fā)生在放療治療后6 周左右，其機(jī)制是射線直接作用于正常肺組織，產(chǎn)生大量的活性氧自由基，然后直接作用于DNA，引起DNA 斷裂和脂質(zhì)過氧化，從而啟動(dòng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等一系列基因活化的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷［5］。MDA 是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物之一［6］，因此該實(shí)驗(yàn)選擇測定照射后肺組織MDA含量，其可以間接反映肺組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的嚴(yán)重程度。聯(lián)合組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)MDA含量與單放組相比，均顯著降低，說明辛伐他汀能夠減輕放射肺損傷引起的脂質(zhì)過氧化。

KARBOWNIK 等［7］報(bào)道，射線照射后細(xì)胞的抗氧化酶活力降低，而抗氧化劑通過提高抗氧化酶活力可減輕細(xì)胞的放射損傷。SOD 能清除超氧陰離子自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受放射損傷，其對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化水平起著極其重要的調(diào)節(jié)作用。另外，SOD 活性的高低能夠反映組織細(xì)胞清除超氧陰離子的能力。本研究結(jié)果顯示，單放組MDA含量各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于聯(lián)合組，說明射線照射可致小鼠肺組織的SOD 活性降低，而辛伐他汀可緩解這一效應(yīng)，從而發(fā)揮抗氧化損傷的防御反應(yīng)，達(dá)到防治放射性肺損傷的作用。

目前研究表明，可能致放射性肺纖維化的細(xì)胞因子很多［8］，其中以腫瘤壞死因子（TNF-α）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）較為重要［9］。TNF-α 通過改變血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，加強(qiáng)血管滲出，刺激中性粒細(xì)胞等炎性反應(yīng)細(xì)胞的趨化反應(yīng)，誘導(dǎo)前列腺素合成，最終加重炎性反應(yīng)［10］。TGF-β1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂增殖及其成熟分化，促進(jìn)膠原蛋白、黏蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成［11］，而羥脯氨酸是膠原蛋白中的一種特有成分，能間接反映肺內(nèi)膠原纖維代謝狀況［12］。與眾多相關(guān)研究結(jié)果一致［13］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單放組TGF-β1和TNF-α水平明顯高于聯(lián)合組，而單放組肺內(nèi)Hyp含量高、肺損傷程度重，表明辛伐他汀能夠降低放射性肺損傷小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子TGF-β1和TNF-α 水平的表達(dá)，從而減輕放射性肺損傷

本實(shí)驗(yàn)通過建立C57/bl 小鼠放射性肺損傷模型，觀察放療后8 周、16 周、24 周辛伐他汀對(duì)放射性肺損傷的放射防護(hù)作用，結(jié)果表明辛伐他汀對(duì)小鼠肺組織的放射損傷具有放射防護(hù)作用，其可能機(jī)制是通過利用辛伐他汀的抗脂質(zhì)過氧化及下調(diào)TGF-β1、TNF-α 等炎癥因子的表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防肺組織免受放射損傷的目的。此外，本研究發(fā)現(xiàn)空白組和單藥組組織損傷無差異，結(jié)果表明辛伐他汀對(duì)組織幾乎無毒性。因此，辛伐他汀有望成為一種安全有效的預(yù)防和減輕放射性肺損傷的藥物。