熱敏灸抗凋亡減輕腦缺血再灌注損傷

黃丹丹，黃昌燕，張文平

（1.贛南醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病原生物學教研室；2.贛州市立醫(yī)院檢驗科，江西 贛州 341000）

熱敏懸灸對腦卒中患者的康復治療作用顯著［1-4］。熱敏懸灸與傳統(tǒng)懸灸在治療時間和程序上有著本質的區(qū)別，通過適當延長懸灸的持續(xù)時間，并選擇合適的體表熱敏點，被施灸者可出現透熱、擴熱、傳熱等明顯的熱感傳現象，此時的療效也會明顯提高［5］。熱感傳現象是熱敏灸的重要標志，它的出現與否是決定灸療效果的關鍵因素。在我們前期研究工作中觀察到懸灸卒中大鼠大椎穴誘發(fā)的尾部溫度升高與懸灸療效密切相關，這與臨床上熱敏現象與療效密切相關是一致的，并證實了尾溫升高（平均升高3°C）是熱感傳現象在受灸大鼠上的體現［6］。

眾所周知，在急性腦梗死的病理生理發(fā)展過程中，缺血半暗帶區(qū)神經細胞發(fā)生凋亡的程度是影響腦梗死預后的重要因素之一［7］，尋找有效治療方案抑制腦梗死后神經細胞的凋亡是國內外腦保護治療的研究熱點。鑒于熱敏懸灸對腦梗死的顯著療效，本文將從抗神經細胞凋亡的角度，在腦缺血再灌注損傷大鼠熱敏模型的基礎上研究熱敏懸灸對缺血性腦損傷的作用機理。

1 材料和方法

1.1 實驗材料成年SD雄性大鼠（體重220～250 g）［購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司（動物許可證號SCXK2012-0002，SPF 級，動物質量合格證號0245636）］、3%的戊巴比妥鈉、4-0 號絲線、魚線（Simago釣具公司）、艾條（專門用于動物實驗，長12 cm，直徑0.6 cm，艾條由江西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院制造）、電子數字溫度計（產自中國上海醫(yī)用儀表廠）、生理鹽水、2%2，3，5-三苯 基四 唑 氯 化 物（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液、4%多聚甲醛、10%、20%、30%蔗糖、TUNEL 試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）、Leica 2000 顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組大鼠隨機分為3組：假手術組20只、缺血對照組20 只及懸灸組40 只。根據懸灸處理后大鼠尾溫的變化，懸灸組進一步分為2個亞組，即：非熱敏灸組（7 d 內尾溫升高≤1 ℃）和熱敏灸組（7 d內尾溫升高＞1 ℃）。

1.2.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備3%的戊巴比妥鈉以30 mg·kg-1給大鼠腹腔注射麻醉。從頸部正中切開，分離頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈。用4-0 號絲線結扎頸外動脈遠端，再用4-0 號絲線結扎頸總動脈近端，另一根絲線松散的扎在頸總動脈分叉處。用一根頭部圓潤，直徑0.205 mm、長5 cm的魚線由頸總動脈插入，輕輕向前推進至大腦中動脈起始部（距離頸總動脈分叉處18 mm），而后，纏繞在頸總動脈上的絲線扎緊以阻止血流。經過2 h 栓塞后，魚線從大腦中動脈的起始部抽出，使腦部血液再灌注。假手術組采用相同的操作手法，但不閉塞大腦中動脈。如術后24 h 內死亡、神經功能缺損評分為0分以及腦組織離體評估為蛛網膜下腔出血的大鼠不計入最終的統(tǒng)計分析。

1.2.3 懸灸治療懸灸時室內溫度維持在（25±2）℃。選取對腦功能有重要影響的大椎穴為受試穴［8］，將大鼠大椎穴處皮膚去毛，在距離皮膚約3 cm處用艾條每天懸灸1 次，每次懸灸40 min，共7 d，首次懸灸于大鼠缺血再灌注后6 h進行。

1.2.4 尾溫測量用電子數字溫度計精確測量懸灸組大鼠尾部中點的溫度。靜息時1次，開始灸后，每隔2 min 測1 次，灸40 min，共測量21 次。測量環(huán)境保持安靜，室溫維持在（25±2）℃。實驗開始前需將大鼠放置于籠中30 min。

1.2.5 神經功能缺損評分由實驗成員以外的測試者應用大鼠改良神經功能缺損評分量表（mNSS）［9］，分別在大腦中動脈栓塞再灌注后0 h、24 h、72 h 和7 d 進行神經功能缺損評估。該評分為18 分制，正常為0分，最高功能缺損為18分。

1.2.6 梗死體積的評估為觀察熱敏灸干預措施對大鼠大腦中動脈梗死后腦梗死體積變化的影響，將缺血再灌注72 h 后的大鼠用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頸處死后在冰上直接取腦并于－20 ℃冷凍20 min，隨后將大鼠大腦置入專用的腦槽，在冰上進行大腦冠狀切片，每片厚2 mm，隨即將腦片浸入2%TTC 染液中，在37 ℃下避光孵育30 min，再用4%多聚甲醛固定12 h，紅色為正常腦組織，白色為梗死腦組織。用IPP 6.0 計算機圖像分析系統(tǒng)對圖片進行分析，腦梗死體積的計算方法如前所述［10］。

1.2.7 TUNEL檢測在大鼠腦缺血2 h再灌注24 h、72 h 兩個時間點，用3%的戊巴比妥鈉深度麻醉動物后，經左心室插管至升主動脈，并剪開右心耳，用生理鹽水250 mL 快速沖洗，隨后用4%多聚甲醛液先快后慢灌注約250 mL，斷頭取腦后置于4%多聚甲醛中固定24～28 h，最后分別用10%、20%、30%的蔗糖脫水過夜。采用冰凍切片法制成厚20 μm的冠狀腦片。細胞凋亡檢測嚴格按TUNEL 試劑盒說明書進行操作。光鏡下神經元胞核中有棕黃色顆粒的為陽性，用IPP 6.0 軟件，對每張切片大腦皮質缺血灶周圍區(qū)TUNEL 陽性細胞的表達進行光密度值檢測，用光密度/面積（IOD/area）表示。

1.3 統(tǒng)計學方法使用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，數據以平均值±標準差表示，應用單向方差法分析數據。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 納入實驗大鼠及其尾溫變化特征20 只假手術組大鼠無一死亡；缺血對照組中有2 只因不符合標準被剔除；懸灸組中有3只因不符合標準被剔除；最終共計75只大鼠納入統(tǒng)計。懸灸開始后，大鼠尾溫開始升高，于5～10 min時，18只大鼠尾溫升高到穩(wěn)定水平，升高幅度平均值≤1 ℃，歸類為非熱敏灸組；19 只大鼠尾溫繼續(xù)升高，于20 min 時達到穩(wěn)定水平，溫度升高幅度平均值＞1 ℃（平均為3℃），歸類為熱敏灸組（見圖1）。

2.2 神經功能缺損評分為檢測懸灸40 min 治療腦缺血再灌注損傷大鼠的療效，我們于再灌注后0 h、72 h 和7 d 對大鼠進行神經功能缺損評分。結果表明，假手術組評分為0 分；0 h 三組評分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05);72 h評分結果顯示，與缺血對照組相比，非熱敏灸組、熱敏灸組神經功能缺損評分逐漸降低，熱敏灸組與缺血對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第7 d 評分結果顯示，與缺血對照組相比，非熱敏灸組、熱敏灸組神經功能缺損評分均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與非熱敏灸組相比，熱敏灸組神經功能缺損評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖1 艾灸大鼠尾溫變化特征

圖2 大鼠神經功能缺損評分

2.3 腦梗死體積的比較TTC 染色法檢測腦缺血再灌注損傷大鼠72 h 的腦梗死體積，結果顯示：熱敏灸組大鼠腦梗死體積百分比明顯低于非熱敏灸組（P＜0.05）；與缺血對照組相比，熱敏灸組大鼠腦梗死體積百分比降低（P＜0.01）；而非熱敏灸組與缺血對照組比較，雖然梗死體積有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05)。見圖3。

2.4 TUNEL 檢測結果于腦缺血再灌注后24 h和72 h 分別進行TUNEL 檢測。TUNEL 陽性染色為細胞核呈棕黃色顆粒，主要見于缺血灶周圍區(qū)域。72 h較24 h的陽性染色有輕度降低。缺血再灌注后24 h，熱敏灸組與缺血對照組或非熱敏灸組比較，熱敏灸組光密度值均明顯降低（P 均＜0.05），而非熱敏灸組與缺血對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；缺血再灌注后72 h，非熱敏灸組與缺血對照組比較，非熱敏灸組光密度值明顯降低（P＜0.05），而熱敏灸組與缺血對照組或非熱敏灸組比較，熱敏灸組光密度值明顯降低（分別為P＜0.01、P＜0.05）。見圖4。

圖3 缺血再灌注72 h后各組腦組織TTC染色評估腦梗死體積比較

圖4 TUNEL檢測神經細胞調亡

3 討 論

熱敏灸是一項繼承于傳統(tǒng)艾灸，但在灸位、灸量和灸時上都有創(chuàng)新的現代灸療技術，因其發(fā)現灸療熱敏新規(guī)律，從而顯著提高了臨床灸療療效［11］。熱敏灸的核心思想是：“辨敏施灸，消敏定量，敏消量足”，它以舒適、高效、無毒副作用等優(yōu)勢，廣泛應用于臨床各科室，尤其在難治性病癥上，收到了許多意想不到的效果［12-14］，腦梗死就是其中之一。

目前，許多研究表明腦缺血再灌注損傷的作用機理與細胞凋亡存在著密切的聯(lián)系［15-17］。研究熱敏灸治療腦梗死對神經細胞凋亡的影響，有助于揭示熱敏灸治療腦梗死的機理。此外，熱敏灸技術的重要特征之一是在懸灸熱敏腧穴時，出現以下一種或幾種艾灸熱敏現象［18］：①透熱，即灸熱從施灸處表面透向深部組織甚至五臟六腑；②擴熱，即灸熱由灸點向四周擴散；③傳熱，即灸熱由灸點沿著某一條線路向遠處甚至病所傳導；④局部不熱或微熱而遠部熱，即灸點不熱或微熱，但離灸點遠處熱；⑤表面不熱或微熱而深部熱，即灸點表面不熱或有微熱，但灸點皮下深部組織等有熱感；⑥產生其他非熱的感覺，即灸點或遠離灸點處產生麻、酸、脹、痛等不是熱覺的奇異灸感現象。伴隨這些熱敏現象的出現，灸感傳導之處，病癥緩解?？梢?，熱敏現象的出現是界定熱敏灸與普通艾灸的關鍵所在。張毫、XIAO A J 等［19-20］曾通過熱敏灸對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦皮質神經細胞凋亡進行過研究，然而這些研究僅從灸療時間上將普通艾灸組和熱敏灸組進行簡單區(qū)分，并未提及受灸大鼠是否出現熱感傳現象，也未設定熱敏判定標準，對實驗動物的分組缺乏科學性，對神經細胞凋亡的研究結果有失嚴謹。

在我們前期的研究工作中發(fā)現艾灸腦缺血再灌注損傷模型大鼠時，部分大鼠尾部出現溫度明顯升高的現象（平均升高3 ℃），且該升高的反應無法用艾熱輻射解釋，最后證明該現象為艾灸熱敏現象在腦缺血再灌注損傷模型大鼠上的體現［6，21］?；谏鲜鰺崦裟Ｐ偷难芯拷Y果，本實驗對熱敏灸干預腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經細胞凋亡進行研究，以期解釋其治療機理。

傳統(tǒng)懸灸的時間每次一般為10～15 min，或者以局部皮膚潮紅為度，往往達不到治療個體化的最佳灸量；而熱敏灸通常需要較長時間，一般為30～60 min，故本研究選取40 min 作為治療時間。在懸灸大鼠時，有18 只大鼠尾溫平均升高≤1 ℃，這種程度的升高與艾熱輻射有關，而其他19只大鼠尾溫平均升高＞1 ℃，平均約3 ℃，且非艾熱輻射所致，為熱敏現象的體現。熱敏灸理論指出［10］，不同個體即使患同一種疾病，所出現的熱敏穴位也會有所不同?；蛟S這18 只大鼠的熱敏穴位不在大椎穴上，因此懸灸固定的大椎穴，一定會有部分大鼠沒有熱敏反應。

在檢測細胞凋亡時，我們發(fā)現腦缺血再灌注后第3 天較第1 天陽性染色有輕度降低，這與其他研究結果出現的一般規(guī)律相似［22］。從行為學評分和TUNEL 染色結果分析，非熱敏灸組即代表普通艾灸，對腦缺血再灌注損傷大鼠在抑制神經細胞凋亡、改善行為學方面雖然有一定作用，但與熱敏灸比較，仍存在很大的差距。從腦梗死體積檢測中我們可以看到，伴隨熱敏現象的腦缺血再灌注大鼠，梗死體積明顯減少，這都有助于盡可能保留正常組織、減輕神經細胞凋亡、降低神經功能缺損評分。

本研究建立在腦缺血再灌注損傷大鼠熱敏模型的基礎上，從抗細胞凋亡角度揭示了熱敏灸高效治療中風的機制。當然，影響腦梗死預后的因素除了細胞凋亡，還涉及諸如興奮性毒性、炎癥、血管通透性、氧化應激等病理生理過程，進一步對相關機制進行研究有助于更加全面認識熱敏灸治療缺血性卒中的作用機理。