LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌中的表達及其與患者預后的關系

賴志亨，鄒 江

海南省中醫(yī)院肛腸科，海南?？?570203

結(jié)直腸癌是全球發(fā)病率僅次于肺癌和乳腺癌的第三大癌癥，其病死率僅次于肺癌，每年導致約60萬例腫瘤相關病例死亡[1]。雖然結(jié)直腸癌的治療有效率在不斷提高，但是患者的生存率和生存質(zhì)量仍然不盡如人意，因此急需研究新的治療方法[2]。結(jié)直腸癌是一種復雜的多基因疾病，其具體的發(fā)病機制尚未完全明確。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中起著至關重要的作用，許多研究已經(jīng)證實lncRNA異常表達是結(jié)直腸癌發(fā)病的重要調(diào)控機制之一[3-4]。LINC00261是腫瘤相關lncRNA之一，在非小細胞肺癌和肝細胞肝癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌因子的作用[5-6]。lncRNA通常作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)結(jié)合微小RNA(miRNA)發(fā)揮作用[7]。在非小細胞肺癌中LINC00261通過與微小RNA-522-3p(miR-522-3p)直接結(jié)合發(fā)揮抑癌作用[8]。miR-522-3p是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，其可有效促進骨肉瘤細胞的生長[9]。目前LINC00261、miR-522-3p與結(jié)直腸癌關系的研究較少，二者在結(jié)直腸癌中是否具有調(diào)控作用尚不清楚。本研究旨在探討LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌中的表達及相關性，并分析了二者與患者預后的關系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2014年12月在本院行手術治療的結(jié)直腸癌患者為研究對象。共納入結(jié)直腸癌組織標本68例和其配對的癌旁組織標本68例。患者年齡36～75歲，平均(65.51±8.38)歲；男42例，女26例；部位：結(jié)腸38例，直腸30例；腫瘤最大徑：≤5 cm 50例，>5 cm 18例；浸潤深度：T1 33例，T2 21例，T3 10例，T4 4例；分化程度：高分化30例，中分化26例，低分化12例；臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期21例，Ⅲ期20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無21例，有47例。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過，患者及家屬均簽署知情同意書。納入標準：(1)患者均初次進行手術治療，且未接受過其他任何形式的抗腫瘤治療；(2)均獲得手術切除組織，并經(jīng)病理專家證實為結(jié)直腸癌組織和癌旁組織；(3)具有完整的臨床病理資料和隨訪資料。排除標準：(1)發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移；(2)合并有其他類型的腫瘤；(3)合并有嚴重器質(zhì)性疾病者。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購自北京天漠科技開發(fā)有限公司，氯仿、異丙醇和無水乙醇購自天津風船化工有限公司；DEPC水購自上海生工有限公司；Nanodrop2000購自美國Thermo公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；LINC00261、miR-522-3p和內(nèi)參U6引物由美國Invitrogen有限公司合成。7500實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1實時熒光定量PCR 手術切除的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織立即凍于液氮中，采用研缽將其研磨后加入Trizol試劑1 mL裂解，移至EP管后加入氯仿200 μL混勻靜置5 min，4 ℃高速離心30 min，吸取最上層水相層溶液450 μL與等體積的異丙醇混勻后4 ℃高速離心30 min，可見EP管底部白色沉淀為RNA，無水乙醇洗滌兩次，加入DEPC水溶解RNA，測得RNA純度(A260 nm/A280 nm為1.8～2.0時，純度較高)和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應體系：5×PrimeScript Buffer 24 μL，PrimeScript RT Enzyme mix Ⅰ 1 μL，Oligo dT primer 1 μL，Random 6 mers 1 μL，總RNA 0.5 μg，RNase Free H2O補足20 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃ 30 s將總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。

以cDNA為模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒說明書配制qRT-PCR反應體系，cDNA模板2 μL、ddH2O 2 μL、引物F 0.4 μL、引物R 0.4 μL、ROX Reference Dye 0.2 μL，SYBR Premix EX TaqTMⅡ 5 μL，總體積10 μL。擴增反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。7500實時熒光定量PCR儀上機檢測各樣品的循環(huán)閾值(Ct)。采用2-ΔΔCt公式以U6基因為內(nèi)參，計算LINC00261和miR-522-3p的相對表達量。LINC00261引物F：5′-ACA TTT GGT AGC CCG TGG AG-3′；R：5′-TCT TCC CCG GAG AAC TAG CA-3′。miR-522-3p引物F：5′-GGG CTC TAG AGG GAA GCG C-3′；R：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。內(nèi)參U6引物F：5′-CTT CGG CAG CAC ATA TAC T-3′；R：5′-AAA ATA TGG AAC GCT TCA CG-3′。

1.3.2隨訪方法 患者術后采用電話詢問或者門診查詢的方式每隔3個月隨訪1次，直至患者死亡或者完成5年隨訪時間時截止。

2 結(jié) 果

2.1LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平 LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達水平低于其在癌旁組織中的表達水平(P<0.05)，miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平高于其在癌旁組織中的表達水平(P<0.05)，見表1。

表1 LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達水平

2.2結(jié)直腸癌組織中LINC00261、miR-522-3p表達水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關系 LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑和浸潤深度均無關(P>0.05)，與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(P<0.05)。miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大徑、浸潤深度和分化程度均無關(P>0.05)，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(P<0.05)。見表2。

表2 LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關系

2.3結(jié)直腸癌組織中LINC00261、miR-522-3p表達水平對患者預后的影響 對68例結(jié)直腸癌患者進行隨訪，其中35例死亡，33例存活，5年生存率為48.53%。

根據(jù)LINC00261在結(jié)直腸癌組織中的表達水平分為LINC00261高表達組(>0.64，32例)和LINC00261低表達組(≤0.64，36例)。LINC00261高表達組的5年生存率為65.63%(21/32)，LINC00261低表達組的5年生存率為33.33%(12/36)。繪制Kaplan-Meier生存曲線，Log Rank檢驗分析顯示LINC00261低表達組的預后比LINC00261高表達組預后更差(χ2=5.762，P=0.021)。

根據(jù)miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平分為miR-522-3p高表達組(>1.79，33例)和miR-522-3p低表達組(≤1.79，35例)。miR-522-3p高表達組的5年生存率為36.36%(12/33)，miR-522-3p低表達組的5年生存率為60.00%(21/35)。繪制Kaplan-Meier生存曲線，Log Rank檢驗分析顯示miR-522-3p高表達組的預后比miR-522-3p低表達組的預后更差(χ2=8.710，P=0.016)。

2.4多因素Cox回歸分析結(jié)直腸癌患者預后不良因素 建立Cox比例風險回歸模型，以本研究資料為樣本，以直腸癌患者預后狀況為應變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。經(jīng)臨床和統(tǒng)計專家討論決定，以LINC00261和miR-522-3p表達及表2中P<0.10的指標/因素為自變量。此外，為提高統(tǒng)計效率并使回歸結(jié)果清晰，將原為連續(xù)數(shù)值的LINC00261和miR-522-3p表達指標，按其均值進行分段(分層)，轉(zhuǎn)化成高和低表達的兩分類變量。各變量賦值如下：分化程度中，1為低分化，0為中高分化；臨床分期中，1為Ⅲ期，0為Ⅰ+Ⅱ期；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，1為有，0為無；LINC00261表達中，1為LINC00261表達水平<0.64，0為LINC00261表達水平≥0.64；miR-522-3p表達中，1為miR-522-3p表達水平>1.79，0為miR-522-3p表達水平≤1.79?；貧w過程采用逐步后退法，以進行自變量的選擇和剔除，設定α剔除=0.10，α入選=0.05。多因素Cox回歸結(jié)果顯示，高臨床分期、低分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、LINC00261低表達和miR-522-3p高表達是結(jié)直腸癌患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05，HR>1)，見表3。

表3 多因素Cox回歸分析結(jié)直腸癌患者預后不良的獨立危險因素

2.5LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中表達的相關性 Pearson相關分析顯示，LINC00261與miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平呈負相關(r=-0.422，P<0.001)。

3 討 論

結(jié)直腸癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均較高，隨著飲食習慣的改變和生活壓力的增加，結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈上升趨勢[10]。手術是結(jié)直腸癌最有效的治療方法，主要針對結(jié)直腸癌早期患者，約90%的結(jié)直腸癌早期患者可以通過手術治愈，患者的5年生存率約為90%[11]。但是結(jié)直腸癌的早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者確診時已經(jīng)處于中晚期，出現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移，治療方式為手術切除原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶，輔助化學治療和放射治療，但治療效果不佳，晚期結(jié)直腸癌患者5年生存率僅10%[2]。通過靶向治療與結(jié)直腸癌進展相關的關鍵分子，可以改善結(jié)直腸癌患者的預后，瑞戈非尼、阿帕替尼、呋喹替尼及安羅替尼等小分子靶向藥物已經(jīng)在晚期結(jié)直腸癌治療中取得了較好的療效[12]，但是存在耐藥現(xiàn)象，仍然達不到理想的療效，因此研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵分子，探討結(jié)直腸癌新的治療靶點具有重要的臨床意義。

lncRNA是長度超過200個核苷酸的RNA，參與細胞凋亡、細胞分化、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[13]。lncRNA可充當癌基因和抑癌基因，在腫瘤生長中發(fā)揮關鍵作用，并可以作為調(diào)控腫瘤進展的分子靶點[14]。LINC00261可在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用，ZHOU等[15]采用原位雜交發(fā)現(xiàn)，LINC00261在結(jié)腸癌組織中表達的陰性率高于其附近非癌組織，并與結(jié)腸癌患者的臨床分期相關，LINC00261表達水平降低是影響結(jié)腸癌患者術后無復發(fā)生存時間的獨立危險因素。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，LINC00261在結(jié)直腸癌組織中表達水平降低，LINC00261的表達水平與分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，與ZHOU等[15]的報道基本一致，這提示LINC00261可能參與了結(jié)直腸癌的進展。另一方面，LINC00261低表達組的預后較差，LINC00261低表達是結(jié)直腸癌患者預后不良的獨立危險因素，這表明LINC00261可作為預后判斷的分子標志物。

miR-522-3p在慢性炎癥中首次被報道[16]，目前的研究較少，炎癥與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，但其能否通過調(diào)節(jié)炎癥反應參與結(jié)直腸癌的進展尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中表達增加，其表達水平與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關，且miR-522-3p高表達的結(jié)直腸癌患者的預后較差，miR-522-3p高表達是患者預后不良的獨立危險因素。這表明miR-522-3p可能參與結(jié)直腸癌的惡性進展，是患者預后不良的分子標志物。SHUAI等[17]報道在結(jié)直腸癌組織和細胞系中miR-522-3p的表達增加，miR-522-3p過表達促進細胞增殖，降低細胞凋亡率，發(fā)揮促癌基因的作用。CHEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-522-3p在骨肉瘤中亦呈異常高表達狀態(tài)，且miR-522-3p高表達的患者的預后較差。

miRNA是lncRNA重要調(diào)控機制之一，且一個lncRNA可靶向調(diào)控多個miRNA，YAN等[18]報道LINC00261在結(jié)腸癌細胞中表達水平降低，過表達LINC00261可靶向調(diào)節(jié)miR-324-3p的表達抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移、侵襲能力，促進細胞凋亡，進而影響結(jié)腸癌的進展。此外，在非小細胞肺癌中LINC00261通過調(diào)節(jié)miR-522-3p抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]，而LINC00261是否調(diào)控miR-522-3p的表達參與結(jié)直腸癌的疾病進展尚不清楚。本研究采用Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)，LINC00261和miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中表達水平呈負相關，lncRNA可競爭性抑制miRNA，因此推測LINC00261可能是通過抑制miR-522-3p在結(jié)直腸癌組織中發(fā)揮作用，但是具體的作用機制將在后續(xù)的細胞水平中進行研究。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中LINC00261低表達，miR-522-3p高表達。LINC00261和miR-522-3p均與結(jié)直腸癌患者不良病理參數(shù)和預后相關，兩者在結(jié)直腸癌組織中表達水平呈負相關。LINC00261和miR-522-3p是結(jié)直腸癌患者潛在的預后標志物和治療靶標。