qRT-PCR法用于檢測(cè)模擬環(huán)境表面載體HBV DNA的可行性研究*

陶西萍，來春艷△，趙 娜，魏晨波，薛衛(wèi)寧，郭曉波

陜西省西安市中心醫(yī)院：1.醫(yī)院感染管理科；2.血液病研究所，陜西西安 710003

感染性疾病病原體可以通過呼吸道、接觸等途徑傳播，污染的環(huán)境表面是間接接觸傳播的重要媒介，特別是在傳染病流行期間，公共場(chǎng)所、醫(yī)療機(jī)構(gòu)環(huán)境表面的污染狀況及傳播風(fēng)險(xiǎn)不容忽視，有文獻(xiàn)報(bào)道，在手足口病/皰疹性咽峽炎獨(dú)立接診候診區(qū)，醫(yī)院環(huán)境腸道病毒污染陽性率為47.50%，環(huán)境表面腸道病毒污染有傳播的風(fēng)險(xiǎn)，但我國(guó)尚無環(huán)境表面病毒污染狀況檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，探索科學(xué)、可行的檢測(cè)方法成為一項(xiàng)重要課題[1]。有學(xué)者運(yùn)用ELISA法檢測(cè)環(huán)境表面乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)來證實(shí)環(huán)境表面存在HBV污染，但無法判斷檢測(cè)樣本是否具有感染能力，對(duì)于環(huán)境表面的清潔消毒、感染防控指導(dǎo)意義較小[2-3]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR法)目前已廣泛用于臨床血液樣本中多種病毒的檢測(cè)，但由于無相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，較少用于環(huán)境表面病毒的檢測(cè)[4]。本研究用HBV載體模擬環(huán)境表面，并探索性應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)HBV DNA，以驗(yàn)證qRT-PCR法用于環(huán)境表面病毒核酸檢測(cè)的可行性。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 采樣液(天津?yàn)笕A科生物科技有限公司生產(chǎn)，主要成分為氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、慶大霉素及兩性霉素)、生理鹽水；4種HBV標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為5×106、5×105、5×104、5×103IU/mL)；HBV核酸測(cè)定試劑盒(熒光PCR法，上海之江生物科技股份有限公司)；Autrax全自動(dòng)核酸提取站；SLAN-96P型熒光定量PCR儀等。

1.2方法

1.2.1環(huán)境表面HBV載體的制備 載體制備：將非光滑的PVC塑料板剪成5 cm×5 cm大小，首先用流動(dòng)水清洗、2 000 mg/L含氯消毒劑浸泡30 min后清洗、擦拭、晾干后作為試驗(yàn)對(duì)象。HBV載體制備：應(yīng)用移液槍分別吸取5×106、5×105、5×104、5×103IU/mL的HBV標(biāo)準(zhǔn)品100 μL于不同載體上，用棉簽涂抹均勻，自然干燥，制備成4種濃度HBV標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體。選用兩種濃度(5×106IU/mL和5×104IU/mL)的HBV標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體，分別用運(yùn)送培養(yǎng)基和生理鹽水進(jìn)行采樣，相同濃度、相同采集液重復(fù)3次，共計(jì)12個(gè)標(biāo)本，檢測(cè)載體表面HBV DNA濃度，取均值進(jìn)行比較分析。

1.2.2采樣方法 參照醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中物體表面微生物采樣方法[5]，用浸有運(yùn)送培養(yǎng)基棉拭子1支，在模擬載體表面橫豎往返各涂抹5次，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，折去手接觸部分，將棉拭子放入1 mL運(yùn)送培養(yǎng)基中密閉送檢。

1.2.3檢測(cè)方法 采用qRT-PCR法檢測(cè)。所有采集的標(biāo)本均在24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)前將標(biāo)本置于微量振蕩器上震蕩1 min，充分混勻后，按照HBV核酸測(cè)定試劑盒(qRT-PCR法)及PCR擴(kuò)增儀使用指導(dǎo)書規(guī)定的方法進(jìn)行，測(cè)定1次即為結(jié)果。整個(gè)試驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行，同時(shí)做內(nèi)參、陰性和陽性對(duì)照，均在控。該試劑的線性檢測(cè)范圍為(1×102～1×108)IU/mL，最低檢出限為20 IU/mL，若檢測(cè)結(jié)果超出檢測(cè)范圍，予以復(fù)測(cè)并取平均值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用Excel錄入數(shù)據(jù)；采用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均值表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1采用不同采樣液時(shí)HBV DNA檢出情況 以運(yùn)送培養(yǎng)基為采樣液，兩種濃度(5×106、5×104IU/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體表面HBV DNA陽性檢出率均為100%，檢測(cè)濃度的均值分別為6.81×103IU/mL和5.33×10 IU/mL；以生理鹽水為采樣液，兩種濃度(5×106、5×104IU/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體表面HBV DNA陽性檢出率均分別為100.0%和66.7%，檢測(cè)濃度的均值分別為9.79×102IU/mL和1.86×10 IU/mL。以運(yùn)送培養(yǎng)基為采樣液的檢出率均大于或等于以生理鹽水為采樣液者。見表1。

表1 以運(yùn)送培養(yǎng)基和生理鹽水為采樣液時(shí)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體表面HBV DNA的檢出情況

2.2不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體放置3、7 d的HBV DNA陽性檢出率 4種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體各20份，其中10份放置3 d、10份放置7 d，檢測(cè)載體表面HBV DNA濃度，樣本合計(jì)80份。檢測(cè)結(jié)果顯示，HBV DNA總陽性檢出率為93.8%(75/80)。所有載體放置3 d的總陽性檢出率為92.5%(37/40)，放置7 d的總陽性檢出率為95.0%(38/40)，陽性檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 載體放置3、7 d后HBV DNA陽性檢出情況

2.3不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體放置3、7 d的HBV DNA濃度比較 4種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體放置3 d后，載體表面檢出的HBV DNA濃度均值分別為3.109×105、3.607×104、4.301×103、2.940×102IU/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.327，P<0.001)；放置7 d后，載體表面檢出的HBV DNA濃度均值分別為2.874×105、2.450×104、1.554×103、1.683×102IU/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.302，P=0.001)。對(duì)4種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品污染的載體放置3 d后HBV DNA濃度下降值與放置7 d后的下降值進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 載體放置3、7 d的HBV DNA濃度(IU/mL)

3 討 論

病毒在環(huán)境表面的污染狀況受到越來越多的專業(yè)人員及社會(huì)關(guān)注，特別是在病毒相關(guān)感染性疾病流行期間。我國(guó)《公共場(chǎng)所衛(wèi)生指標(biāo)與限值要求》中無環(huán)境表面衛(wèi)生指標(biāo)；《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中物體表面衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中也無病毒檢測(cè)要求及病毒檢測(cè)方法；疾病預(yù)防控制中心等部門在對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)、公共場(chǎng)所的日常檢測(cè)中也未開展病毒檢測(cè)。尹海等[6]、李存桂等[7]、陳美珍等[8]學(xué)者應(yīng)用ELISA法對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)環(huán)境表面行HBsAg檢測(cè)，證實(shí)了環(huán)境表面存在HBV病毒污染，但不能證實(shí)是否存在傳染的風(fēng)險(xiǎn)。檢出HBV DNA是病毒復(fù)制和傳染性的最可靠的指標(biāo)，PCR技術(shù)檢測(cè)病毒核酸對(duì)于評(píng)價(jià)病毒污染比ELISA法檢測(cè)抗原、抗體更有意義，更能評(píng)估病毒傳染的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究用HBV標(biāo)準(zhǔn)品污染載體模擬環(huán)境表面，并探索性應(yīng)用qRT-PCR法檢測(cè)病毒DNA。qRT-PCR法與常規(guī)PCR法相比，其靈敏度更高，檢測(cè)限可低至20 IU/mL。由于qRT-PCR法目前主要用于臨床血清、體液標(biāo)本的檢測(cè)，本研究選用4種濃度標(biāo)準(zhǔn)品污染載體，最低濃度(5×103IU/mL)污染的載體放置7 d仍可檢出HBV DNA，說明該檢測(cè)方法用于環(huán)境表面標(biāo)本等非人體標(biāo)本檢測(cè)具有一定可行性。

既往環(huán)境表面細(xì)菌學(xué)檢測(cè)采樣液多為生理鹽水，因無環(huán)境表面病毒檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，本研究應(yīng)用的病毒運(yùn)送培養(yǎng)基是以氯化鈉和葡萄糖為主要原料，通常用于對(duì)人體血清、體液等標(biāo)本進(jìn)行病毒檢測(cè)，尚未用于環(huán)境表面；因此，本研究分別采用生理鹽水及運(yùn)送培養(yǎng)基作為采樣液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，采樣液為運(yùn)送培養(yǎng)基時(shí)，載體表面HBV DNA的陽性檢出率較高，因此可以選擇運(yùn)送培養(yǎng)基為環(huán)境表面HBV污染狀況的采樣液。此外，病毒運(yùn)送培養(yǎng)基采樣液為3～6 mL，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，宋向陽等[9]對(duì)胃鏡表面HBV污染狀況進(jìn)行采樣時(shí)，選擇1 mL的采樣液，因此最終選用1 mL采樣液，既保證了檢測(cè)需求，又可提高檢出率。

HBV感染者在醫(yī)療機(jī)構(gòu)內(nèi)進(jìn)行手術(shù)、穿刺及各種治療，極易將血液、體液噴濺、沾染到環(huán)境表面[10]，若未進(jìn)行有效的清潔消毒處理，可能存在較長(zhǎng)時(shí)間的污染，有一定的感染風(fēng)險(xiǎn)。有研究者報(bào)道，HBV可以在外部環(huán)境中存活7 d[11]，本研究結(jié)果顯示，qRT-PCR法在放置3 d和7 d的HBV載體表面仍能檢測(cè)出HBV DNA，充分證明了qRT-PCR法用于污染一定時(shí)間后的環(huán)境表面病毒核酸檢測(cè)的可行性。新型冠狀病毒肺炎疫情期間，疾病預(yù)防控制中心、部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)也嘗試性地在部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)、公共場(chǎng)所進(jìn)行了病毒核酸定性檢測(cè)[12-13]，本研究采用qRT-PCR法定量檢測(cè)污染載體的HBV DNA，該研究方法可應(yīng)用于其他病毒污染的環(huán)境表面的檢測(cè)，結(jié)果可為有關(guān)部門制訂環(huán)境表面病毒檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。