異甘草素對結(jié)直腸癌細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用研究*

唐 越，李欣雨，彭鈺凌，賀吉春，李秋香，伍怡穎

成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都 610000

結(jié)直腸癌是消化道常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在癌癥中位于前4位[1-3]。結(jié)直腸癌早期不容易被發(fā)現(xiàn)，患者確診時已錯過手術(shù)治療最佳時間，同時，該病具有較高的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率[4-5]，因此大多數(shù)患者需要接受傳統(tǒng)放化療改善預(yù)后[6]。但化學(xué)治療藥物的不良反應(yīng)較多，而天然藥物具有多種優(yōu)勢，例如毒性小、靶點多等[7]。

異甘草素(ISL)主要來源于植物甘草，具有增強(qiáng)免疫功能、減輕炎癥等作用[8-10]。近來在卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，ISL有較好的抗腫瘤作用[11-12]。但其對結(jié)直腸癌的作用及抗癌機(jī)制還不清楚。因此，本研究擬從體內(nèi)外兩方面探討ISL對結(jié)直腸癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116、SW480和小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株CT26購自中國科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞庫；ISL購自美倫生物科技有限公司；溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)購自碧云天生物有限公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒購自凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1MTT法測定ISL對HCT-116、SW480細(xì)胞體外增殖的影響 將HCT-116、SW480細(xì)胞以1×104個/孔鋪于96孔板。待貼壁后，HCT-116細(xì)胞分別加入梯度濃度的ISL(10、20、40、60、80、100 μmol/L)，同樣SW480細(xì)胞中也加入梯度濃度的ISL(20、60、100、140、180、220 μmol/L)，對照組細(xì)胞不經(jīng)藥物處理。24 h后，每孔分別加入10 μL MTT，4 h后，加二甲基亞砜(DMSO)，于酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測光密度值。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測ISL對HCT-116、SW480細(xì)胞凋亡的影響 將HCT-116、SW480細(xì)胞以2×105個/孔鋪于6孔板。待貼壁后，加入不同濃度的ISL處理24 h，按說明書收集細(xì)胞，加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶(PI)染色，于流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測ISL對HCT-116、SW480細(xì)胞周期的影響 將HCT-116、SW480細(xì)胞以2×105個/孔鋪于6孔板。待貼壁后，加入不同濃度的ISL(20、40、60、80 μmol/L)處理24 h，按說明書收集固定細(xì)胞，PI染色，于流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4劃痕實驗分析ISL對HCT-116、SW480細(xì)胞遷移力的影響 將HCT-116、SW480細(xì)胞以5×105個/孔鋪于6孔板。待貼壁后，加入不同濃度的ISL進(jìn)行干預(yù)。用10 μL移液槍頭在孔板內(nèi)底部輕劃3～5條等距平行線，顯微鏡下拍照初始劃痕距離。待ISL作用24、48、72 h后，分次取出6孔板，顯微鏡下拍照、觀察。

1.2.5復(fù)制CT-26荷瘤小鼠模型觀察ISL對小鼠移植瘤生長的影響 將CT26細(xì)胞制成濃度為1×107個/毫升的細(xì)胞懸液。取雄性BALB/C小鼠，于右側(cè)腋下注射CT26細(xì)胞，每只100 μL，復(fù)制小鼠結(jié)直腸癌移植瘤模型。當(dāng)小鼠腋下腫瘤生長到40～50 mm3時，將體質(zhì)量和腫瘤大小較一致的小鼠選出，共18只，隨機(jī)分為ISL低濃度組、ISL高濃度組和陰性對照組，每組6只。并按分組給藥，低濃度組腹腔注射ISL 30 mg/(kg·d)，高濃度組腹腔注射ISL 60 mg/(kg·d)，陰性對照組腹腔注射蒸餾水100 μL/[(10 g)·d]。每天記錄小鼠的體質(zhì)量和腋下腫瘤體積。10 d后，處死全部小鼠，剝?nèi)∧[瘤并稱取質(zhì)量。采用4%的多聚甲醛固定瘤塊，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、染色、顯微鏡下拍照、觀察。

2 結(jié) 果

2.1ISL在體外對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況的影響 MTT法檢測結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖率隨ISL濃度的升高而顯著降低(P<0.01)。ISL濃度為20、40、60、80、100 μmol/L時，HCT-116細(xì)胞增殖抑制率分別為(11.05±2.84)%、(27.94±6.69)%、(50.64±5.68)%、(56.25±4.24)%、(70.65±3.86)%。SW480細(xì)胞在ISL濃度為60、100、140、180、220 μmol/L時的細(xì)胞增殖抑制率分別為(34.25±1.79)%、(40.63±1.44)%、(50.11±3.15)%、(81.50±1.06)%、(58.62±3.25)%。結(jié)果表明ISL可呈濃度依賴性的抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞體外增殖。

2.2ISL對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡情況的影響 在ISL干預(yù)24 h后，HCT-116細(xì)胞及SW480細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高(P<0.01)。HCT-116細(xì)胞在80 μmol/L的ISL作用后，總凋亡率為(72.22±5.48)%。SW480細(xì)胞在180 μmol/L的ISL作用后，總凋亡率為(62.23±0.86)%。結(jié)果表明，ISL呈濃度依賴性促使人結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3ISL對結(jié)直腸癌細(xì)胞周期的影響 經(jīng)ISL干預(yù)24 h后，HCT-116和SW480細(xì)胞中G1/G0期細(xì)胞比例降低(P<0.01),S期細(xì)胞比例增加(P<0.05)。結(jié)果表明，ISL可以將結(jié)直腸癌細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制細(xì)胞生長。見圖1。

注：A為不同濃度的ISL干預(yù)HCT-116細(xì)胞后，細(xì)胞在各周期中的分布情況；B為不同濃度的ISL干預(yù)SW480細(xì)胞后，細(xì)胞在各周期中的分布情況；與ISL濃度為0 μmol/L時比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4ISL對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移力的影響 對照組的細(xì)胞劃痕隨著時間逐漸變窄，細(xì)胞向中間遷移。而經(jīng)ISL處理后細(xì)胞遷移距離較短，劃痕間隙較大。結(jié)果表明，ISL可顯著抑制HCT-116和SW480細(xì)胞的遷移。見圖2。

注：A為ISL對HCT-116細(xì)胞遷移力的影響，B為ISL對SW480細(xì)胞遷移力的影響。

2.5ISL對小鼠結(jié)直腸癌移植瘤生長的影響 ISL干預(yù)后小鼠結(jié)直腸癌移植瘤生長緩慢，腫瘤體積較小(P<0.05)，質(zhì)量減輕(P<0.05)。ISL低濃度組和高濃度組的抑瘤率分別為(22.89±5.09)%和(30.99±3.34)%。HE染色結(jié)果顯示，ISL高濃度組腫瘤組織壞死區(qū)較大，細(xì)胞核溶解，細(xì)胞輪廓顯示不清，血管輪廓被破壞，而陰性對照組中腫瘤細(xì)胞分布緊密，未見大片壞死區(qū)域。見圖3。

注：A為小鼠腫瘤質(zhì)量在不同濃度ISL作用下的變化；與陰性對照組比較，*P<0.05。B為采用HE染色觀察小鼠移植瘤的組織病理改變。

3 討 論

ISL是從草本類豆科植物甘草中所提取，已發(fā)現(xiàn)有器官保護(hù)、調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥等作用，屬黃酮類化合物[10]。隨著對ISL功能活性研究的深入，發(fā)現(xiàn)ISL對乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤表現(xiàn)出抗癌潛力。其可通過促使腫瘤細(xì)胞凋亡、引發(fā)自噬、阻滯細(xì)胞周期及抑制新生血管形成等途徑，延緩腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移[11]。

如在宮頸癌細(xì)胞中，ISL可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑，引發(fā)HeLa細(xì)胞凋亡[13]。ISL還能通過降低人乳頭瘤病毒(HPV)16 E6、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因的蛋白表達(dá)水平，同時上調(diào)Bax的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制宮頸癌細(xì)胞生長的作用[14]。ISL可通過降低乳腺癌PI3K/Akt及NF-kappa B等信號通路的活性，進(jìn)而抑制乳腺癌腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移[15]。在前列腺癌中，ISL可阻滯細(xì)胞周期，引發(fā)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞增殖力，其抗前列腺癌作用可能與活性氧(ROS)水平降低有關(guān)[16-18]。

近年來，隨著對ISL研究的深入，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌的抗腫瘤活性中具有一定作用，體外研究顯示，ISL可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116、SW620細(xì)胞增殖及侵襲[19]。給小鼠用ISL灌胃能有效抑制由AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸癌的發(fā)生[7]。但目前有關(guān)ISL抗結(jié)直腸癌的作用研究還較少，且缺少體內(nèi)移植瘤的實驗研究。

當(dāng)受到外界干擾或基因調(diào)控異常時，細(xì)胞周期進(jìn)程以及增殖失去控制，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的形成。因此，阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制其增殖或誘發(fā)凋亡，均可有效延緩腫瘤的生長和惡性發(fā)展，同時也是評估抗腫瘤藥物效果的重要指標(biāo)。本研究首先通過MTT法檢測HCT-116、SW480細(xì)胞在梯度濃度ISL作用后的增殖變化，結(jié)果顯示，隨著ISL濃度增加，細(xì)胞增殖率明顯下降(P<0.05)，表明ISL能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外增殖，并呈濃度依賴性。同時利用流式細(xì)胞術(shù)檢測ISL對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡及周期的影響發(fā)現(xiàn)，ISL干預(yù)后細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，與細(xì)胞增殖實驗結(jié)果一致。高濃度ISL作用后S期細(xì)胞比例增加(P<0.01)，提示ISL具有細(xì)胞周期阻滯作用，可將細(xì)胞阻滯在S期，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長。

結(jié)直腸癌為易轉(zhuǎn)移性癌，而癌癥轉(zhuǎn)移主要取決于癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力。因此本研究采用劃痕實驗檢測了ISL對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移力的影響。結(jié)果顯示，ISL明顯抑制HCT-116及SW480細(xì)胞向劃痕間隙移動，降低細(xì)胞的遷移力。

此外，為進(jìn)一步明確ISL的體內(nèi)抗結(jié)直腸癌作用，本研究還復(fù)制了CT-26結(jié)直腸癌荷瘤小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISL能明顯抑制小鼠移植瘤生長，殺傷腫瘤細(xì)胞。

綜上所述，本研究表明ISL可促使結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞周期于S期阻滯以及細(xì)胞遷移力下降，并可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外增殖及小鼠體內(nèi)移植瘤生長。提示ISL將可能成為結(jié)直腸癌的潛在治療藥物，但其抗結(jié)直腸癌作用分子機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。