IL-33調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境中IFN-γ的生物信息學(xué)分析

韓鴻舉 蘇子陽 周玉潔 王 璽

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069)

白細(xì)胞介素-33(interleukin-33，IL-33)在抗腫瘤免疫中具有重要作用，可以上調(diào)干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)的表達(dá)，然而具體機(jī)制尚不清楚[1-7]。為了進(jìn)一步探討IL-33在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮的抗腫瘤作用和上調(diào)IFN-γ的機(jī)制，在公共數(shù)據(jù)庫中下載了結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)錄組和肺癌的蛋白組數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。有研究[4]顯示IL-33通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路調(diào)控IFN-γ mRNA的穩(wěn)定性，但是MAPK如何調(diào)控mRNA穩(wěn)定性尚不清楚。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性胞核核糖核蛋白D(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，HNRNPD或AU-rich element binding factor 1，AUF1)可能介導(dǎo)調(diào)控IFN-γ mRNA的穩(wěn)定性[8-12]。為了證實(shí)IL-33是通過下調(diào)AUF1從而影響IFN-γ，本研究對IL-33和AUF1表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及計算差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)

本研究的生物信息數(shù)據(jù)下載自美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NIH)下屬的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和臨床蛋白質(zhì)組腫瘤分析協(xié)會(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC)蛋白和蛋白磷酸化組數(shù)據(jù)庫(https://cptac-data-portal.georgetown.edu/datasets/)。

下載GEO編號GSE109694結(jié)腸癌RNA表達(dá)量芯片數(shù)據(jù)。為了考察IL-33對造血干細(xì)胞來源的免疫細(xì)胞的影響，選取“St2-/-bone marrow into WT host (St2-/-=> WT)”和 “WT bone marrow into WT host (WT=> WT)”兩組進(jìn)行分析。使用R語言進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理計算差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)步驟包括插補(bǔ)空白表達(dá)量、去除重復(fù)基因、數(shù)據(jù)分組、數(shù)據(jù)ENSEMBLID或ENTREZID轉(zhuǎn)換為基因名SYMBOL、對實(shí)驗組和對照組基因表達(dá)值循環(huán)進(jìn)行Student’st-test檢驗、數(shù)據(jù)匯總和分析。使用R語言中的r包“edgeR”中的“DGEList”、“calcNormFactors”、“estimateCommonDisp”、“estimateTagwiseDisp”和“exactTest”函數(shù)計算DEG。參考Gong等[13]的方法，在RNA表達(dá)量中將FDR<0.05且|lgFC|>1定義為差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)。將CPTAC數(shù)據(jù)庫中下載的肺鱗狀細(xì)胞癌(lung squamous cell carcinoma，LSCC)蛋白組數(shù)據(jù)根據(jù)IL-33表達(dá)量中位數(shù)作為劃分臨界值，將病例分為IL-33高表達(dá)和低表達(dá)兩組。考慮到蛋白組數(shù)據(jù)表達(dá)量變化較小，將FC=2設(shè)定為DEG計算的閾值。計算兩組DEG步驟與GEO數(shù)據(jù)處理過程相同。使用R語言中的“plot”、“points”和“abline”函數(shù)進(jìn)行火山圖繪制。

1.2 IL-33相關(guān)Kaplan Meier生存曲線

使用Kaplan Meier(KM) plotter(https://kmplot.com/analysis/) 在線生存分析工具繪制KM曲線，分析IL-33表達(dá)對肺癌、乳腺癌和胃癌患者預(yù)后的影響。基因SYMBOL輸入“IL-33”，使用默認(rèn)中位數(shù)(median)劃分病例，生存參數(shù)選擇“OS”，跟蹤時間選擇全體(all)。使用OncoLnc(http://www.oncolnc. org/)在線生存分析工具繪制KM曲線，分析IL-33表達(dá)對結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響?！皔our favorite gene”中輸入“IL-33”，使用推薦的劃分區(qū)間(33∶33)進(jìn)行患者分組。

1.3 基因本體論(gene ontology，GO)分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析

使用R語言中的r包“clusterProfiler”中的“enrichGO”函數(shù)對DEG進(jìn)行GO富集分析。使用R語言中的r包“ggplot2”中的“barplot”函數(shù)對分析結(jié)果進(jìn)行可視化繪制。

使用R語言中的r包“clusterProfiler”中的“enrichKEGG”函數(shù)對DEG進(jìn)行KEGG富集分析。使用R語言中的r包“ggplot2”中的“barplot”函數(shù)對分析結(jié)果進(jìn)行可視化繪制。

1.4 繪制蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)示意圖

使用STRING(https://string-db.org/)搜尋蛋白質(zhì)相互作用的在線分析工具繪制DEG的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)示意圖(protein-protein interaction network，PPI)。參數(shù)設(shè)定中最小互作分?jǐn)?shù)(minimum required interaction score)設(shè)定為0.9(highest confidence)，隱藏網(wǎng)絡(luò)中未連接的節(jié)點(diǎn)(hide disconnected nodes in the network)。

1.5 計算蛋白表達(dá)相關(guān)系數(shù)

在CPTAC蛋白組數(shù)據(jù)中提取目標(biāo)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)量。使用r包“ggplot2”中的“ggscater”函數(shù)繪制散點(diǎn)圖，使用“stat_cor”函數(shù)計算相關(guān)系數(shù)。“Stat_cor”函數(shù)的“method”參數(shù)設(shè)定為“spearman”。

2 結(jié)果

2.1 IL-33的高表達(dá)改善多種癌癥生存預(yù)后

在1 925例肺癌患者、875例胃癌患者、290例結(jié)腸癌患者和3 951例乳腺癌患者中，IL-33表達(dá)較高的病例生存期顯著延長(圖1)。在肺癌中HR=0.7，LogrankP<0.001；在胃癌中HR=0.79，LogrankP<0.001；在乳腺癌中HR=0.69，LogrankP<0.001；在結(jié)腸癌中LogrankP<0.05。

圖1 IL-33的高表達(dá)改善多種癌癥生存預(yù)后Fig.1 High expression of IL-33 ameliorates the prognosis for lung, gastric, colon, and breast cancer patients A: results in lung cancer; B: results in gastric cancer; C: results in breast cancer; D: results in colon cancer; IL-33: interleukin-33.

2.2 IL-33在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中上調(diào)免疫細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)

經(jīng)過基于負(fù)二項隨機(jī)變量的精確檢驗發(fā)現(xiàn)177個DEG，其中表達(dá)上調(diào)基因62個，表達(dá)下調(diào)基因115個。使用基因表達(dá)差異矩陣?yán)L制火山圖(圖2A)?；鹕綀D中FDR<0.05且lgFC>1的基因所對應(yīng)的點(diǎn)標(biāo)記為紅色?；鹕綀D中FDR<0.05且lgFC<-1的基因所對應(yīng)的點(diǎn)標(biāo)記為綠色。IFN-γ對應(yīng)的點(diǎn)標(biāo)記為棕色。IFN-γ的FDR<0.05,lgFC=-3.7。篩選DEG中FDR<0.05且|lgFC|>3的DEG繪制熱圖(圖2B)。

2.3 結(jié)腸癌中IL-33導(dǎo)致差異表達(dá)基因的GO注釋和KEGG通路富集

對IL-33影響的177個DEG進(jìn)行生物途徑(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)的注釋。選取富集最顯著10個BP、CC和MF結(jié)果繪圖(圖3A)。在BP中，可富集到對IFN-γ的反應(yīng)(Padjust<0.001),對IFN-β的反應(yīng)(Padjust<0.001)，固有免疫調(diào)控(Padjust<0.001),原蟲反應(yīng)(Padjust<0.001)等。在CC中，DEG主要包含：共生相關(guān)空泡(Padjust<0.001),胞外膜捆綁細(xì)胞器(Padjust<0.001),宿主細(xì)胞胞質(zhì)(Padjust<0.001)等。在MF中，主要富集到：GTP酶活性(Padjust<0.001),GTP結(jié)合(Padjust<0.001),嘌呤核糖核酸結(jié)合(Padjust<0.001),核糖核酸結(jié)合(Padjust<0.001)等。

使用R語言進(jìn)行了KEGG信號通路富集分析，選取30個最顯著富集信號通路(圖3B)。細(xì)胞對抗原處理和提呈(Padjust<0.001)、NOD樣受體信號通路(Padjust<0.001)、同種異體移植排斥(Padjust<0.001)、移植物抗宿主病(Padjust<0.001)、吞噬體通路(Padjust<0.001)和一型糖尿病(Padjust<0.001)等通路差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 PPI analysis of DEGPPI: protein-protein interaction network; DEG: differentially expressed gene.

2.4 差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用在線PPI繪制工具STRING對177個DEG進(jìn)行蛋白之間的互作分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)IL-33影響了IFN-γ(lgFC=-3.71)、NOS2(lgFC=-2.38)、STAT1(lgFC=-1.35)、STAT2(lgFC=-1.01)和CXCL10(lgFC=-2.14)等蛋白的表達(dá)，而且IFN-γ與NOS2、STAT1、CXCL10、SOCS1四個蛋白有直接相互作用。

2.5 IL-33在肺癌中與AUF1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

對以IL-33表達(dá)高低作為分組標(biāo)準(zhǔn)并計算的DEG進(jìn)行火山圖繪制結(jié)果見圖5。P<0.05且lgFC>0.3的基因?qū)?yīng)的點(diǎn)標(biāo)記為紅色。P<0.05且lgFC<-0.3的基因?qū)?yīng)的點(diǎn)標(biāo)記為綠色。AUF1的P<0.001，lgFC=-0.36。對DEG進(jìn)行GO注釋和KEGG分析。GO注釋中BP通路主要包括核糖核蛋白復(fù)合體生物合成、核糖體生物合成、非編碼RNA處理等。KEGG分析通路主要富集于細(xì)胞內(nèi)吞作用、剪接體、補(bǔ)體和凝集瀑布等。

圖5 LSCC中IL-33高低表達(dá)組的DEG、GO和KEGG分析結(jié)果Fig.5 DEG, GO and KEGG analysis results in LSCCLSCC: lung squamous cell carcinoma; IL-33: interleukin-33; DEG: differentially expressed gene; GO: gene ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; AUF1: AU-rich element binding factor 1.

對LSCC中IL-33與AUF1的蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-33與AUF1的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖6A，r=-0.64，P<0.001)。同時，在LUAD中也對IL-33和AUF1的蛋白表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)IL-33與AUF1的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.62，P<0.001,圖6B)。

圖6 在LSCC和LUAD中IL-33和AUF1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)Fig.6 Expression of IL-33 negatively correlates with AUF1 in LSCC and LUADA: correlation in LSCC; B: correlation in LUAD; IL-33: interleukin-33; AUF1: AU-rich element binding factor 1; LSCC: lung squamous cell carcinoma; LUAD: lung adenocarcinoma.

3 討論

IL-33是IL-1家族成員[14]，主要表達(dá)于人角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和纖維母細(xì)胞。IL-33的受體ST2在Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞和固有淋巴樣細(xì)胞2(type 2 innate lymphoid cells，ILC2)上高表達(dá)。早期研究[15]顯示IL-33主要在二型免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，對抗腫瘤免疫有負(fù)向調(diào)控作用，但近年來不斷有新的研究[5-7]顯示IL-33在抗腫瘤免疫中也具有正向調(diào)控作用。

在不同癌腫模型[5-7]中關(guān)于IL-33的抗腫瘤免疫正向調(diào)控作用人們也做了大量工作。在黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型中，Lucarini等[7]研究表明IL-33通過嗜酸性粒細(xì)胞抑制了黑色素瘤轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌模型中，Eissmann等[6]發(fā)現(xiàn)，IL-33抑制了結(jié)腸癌的進(jìn)展。St2敲除鼠經(jīng)過azoxymethane (AOM，一種結(jié)腸癌模型誘導(dǎo)劑)處理后，癌腫進(jìn)展明顯較對照組快。Jin等[5]構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)IL-33的H22小鼠肝癌細(xì)胞系，將其接種到小鼠中構(gòu)建小鼠肝癌模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比對照組，過表達(dá)IL-33的肝癌進(jìn)展明顯減慢。

以上結(jié)果都說明IL-33在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。腫瘤免疫參與的免疫細(xì)胞主要包括Th1和自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞，產(chǎn)生的免疫反應(yīng)稱為1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，以IL-12誘導(dǎo)分化為標(biāo)志。然而IL-33如何調(diào)控細(xì)胞免疫目前還不太清楚。研究[16]顯示IL-33在Th1免疫反應(yīng)中依賴轉(zhuǎn)錄因子T-bet和STAT4。T-bet在Th0向Th1分化過程中起決定作用，而STAT4負(fù)責(zé)1型免疫反應(yīng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。Th1細(xì)胞表面的IL-33受體ST2的表達(dá)是一過性的，這也部分解釋了IL-33無法單獨(dú)刺激Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞上調(diào)IFN-γ表達(dá)的原因。IL-33的作用是協(xié)助IL-12在Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞中上調(diào)IFN-γ表達(dá)[4, 17]。Lusty等[18]研究表明STAT4是IL-12激活的下游轉(zhuǎn)錄因子。IL-12/18聯(lián)合刺激時無法進(jìn)一步增強(qiáng)STAT4的激活水平，說明IL-18通過其他機(jī)制增強(qiáng)IL-12的刺激作用。IL-18和IL-33同為IL-1家族成員，可能也有類似的機(jī)制。目前認(rèn)為IL-33輔助IL-12上調(diào)IFN-γ表達(dá)的信號通路中包含Myd88[3]、MAPKp38[4]和MK2/3[19]等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。

本文對GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進(jìn)行了挖掘，計算了DEG，發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中IL-33可以影響IFN-γ的表達(dá)。本文針對DEG進(jìn)行了非監(jiān)督層次聚類、GO分析、KEGG通路富集分析和蛋白網(wǎng)絡(luò)相互作用分析，發(fā)現(xiàn)IL-33和mRNA穩(wěn)定性有一定關(guān)系。

研究[4]顯示IL-33可以穩(wěn)定IFN-γ mRNA。IL-33不僅在結(jié)腸癌中增加了IFN-γ的表達(dá)，在肺癌中也可上調(diào)IFN-γ的表達(dá)[3]，而且有研究[11]提示IFN-γ mRNA穩(wěn)定性易受到AUF1調(diào)控。因此本研究對CPTAC數(shù)據(jù)庫中的肺癌患者數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，通過對關(guān)鍵DEG包括AUF1進(jìn)行了分析，確定了AUF1與IL-33的相關(guān)關(guān)系。AUF1是腺尿核苷酸富集元件(AU-rich element, ARE)結(jié)合蛋白[10]，可與熱休克蛋白27、熱休克蛋白70、翻譯起始因子eIF4G、多聚腺苷尾結(jié)合蛋白和其他未鑒定的蛋白組分組成AUF1和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控復(fù)合體(AUF1- and signal transduction-regulated complex，ASTRC)[20]，該復(fù)合體可招募并降解含ARE的mRNA。

在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯是分開的兩個過程，因此遺傳信息從DNA到蛋白的表達(dá)過程中機(jī)體可在多個節(jié)點(diǎn)上進(jìn)行調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)中的mRNA水平代表了其轉(zhuǎn)錄和降解的平衡,真核細(xì)胞可通過mRNA結(jié)合蛋白調(diào)控不穩(wěn)定mRNA的半衰期,不穩(wěn)定mRNA包括細(xì)胞周期調(diào)控組蛋白、原癌基因、細(xì)胞因子和淋巴因子等基因翻譯出的mRNA。其中一類不穩(wěn)定mRNA如IFN-γ的3′UTR含有ARE[21]，易受到mRNA結(jié)合蛋白如ASTRC的攻擊[11]。

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了AUF1在IL-33調(diào)控IFN-γ中的重要作用，即IL-33可以通過AUF1調(diào)控IFN-γ mRNA穩(wěn)定性，從而為IL-33作為抗腫瘤免疫細(xì)胞因子在臨床上的應(yīng)用和相關(guān)藥物靶點(diǎn)的開發(fā)提供了理論依據(jù)，下一步將通過實(shí)驗進(jìn)一步驗證。