冠狀動脈旁路移植術后心房顫動患者ceRNA機制的研究▲

雷 登 賀陽晨 鄭寶石 馮 旭

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，廣西南寧市 530021)

冠狀動脈旁路移植術(coronary artery bypass grafting，CABG)是一種廣泛開展的外科手術，而患者出現(xiàn)術后心房顫動(postoperative atrial fibrillation，POAF)是CABG術后常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率為20%～50%[1]。POAF的發(fā)病受多種因素影響[1-2]。有研究[3]發(fā)現(xiàn)，POAF和原發(fā)性非手術性心房顫動(以下簡稱房顫)共享遺傳標記，如4q25位點的變異。隨訪研究也發(fā)現(xiàn)，POAF患者長期房顫的發(fā)生率往往更高[4-5]，提示POAF與原發(fā)性房顫密切相關。目前對POAF的診斷主要基于動態(tài)心電圖，這具有明顯的滯后性。POAF是許多不良結(jié)果的獨立預測因子，與患者死亡率和經(jīng)濟負擔加重顯著相關[6-9]，識別POAF的高危人群具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，為癌癥、精神障礙、免疫、心血管病等疾病的重要調(diào)控因子[10-12]。circRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA，充當miRNA海綿發(fā)揮作用，以阻止miRNA與靶mRNA結(jié)合，上調(diào)靶基因表達水平[13]。本研究通過生物信息學方法對miRNA及其靶mRNA進行預測，構(gòu)建circRNA-miRNA-hub基因網(wǎng)絡，探討 circRNA在POAF患者circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡中的機制，為circRNA在POAF中的作用提供新的信息，并有助于探討POAF的潛在發(fā)病機制。

1 材料和方法

1.1 材料 本研究中的circRNA芯片數(shù)據(jù)，我們從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus， GEO)中獲取了數(shù)據(jù)集GSE97455，注釋平臺為GPL21825(074301 Arraystar Human CircRNA microarray V2)。使用GEO2R軟件進行基因差異表達分析，得到GSE97455數(shù)據(jù)集中差異表達的circRNAs(differential expression of the circRNAs，DECs)，調(diào)整后P值<0.05，|logfold-change (FC)|≥1。下載GSE97455的矩陣文件和平臺文件，然后將相應的探針名轉(zhuǎn)換為國際標準的circRNA名稱。

1.2 方法 (1)circRNAs靶向miRNAs的預測：使用Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫[14]預測circRNAs的靶向miRNAs。(2)房顫相關的miRNAs：人類microRNA疾病數(shù)據(jù)庫(Human microRNA Disease Database， HMDD)收集了經(jīng)實驗證實的與miRNAs相關的疾病，包含大約1 206個miRNA和893種疾病[15]。利用HMDD數(shù)據(jù)庫搜索房顫相關的miRNA，然后利用Venny 2.1.0獲得DECs的靶miRNAs與房顫相關的miRNAs的交集，交集中的miRNAs與POAF的相關性更大。(3)miRNA靶基因的預測：利用miRTarBase[16]、TargetScan[17]和miRDB[18]數(shù)據(jù)庫來預測靶基因，將3個數(shù)據(jù)庫中都包含的mRNA作為候選靶mRNA。(4)相關DECs RT-PCR檢測：選取我院心胸外科2019年7月至2020年12月收治的30例CABG患者的術前血液樣本進行RT-PCR檢測相關DECs，其中術后發(fā)生房顫患者8例，未發(fā)生房顫患者22例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。(5)關鍵因子的篩選鑒定和circRNA-miRNA-hub基因的構(gòu)建：STRING 11.0[19]用于預測靶mRNAs之間的關聯(lián)。構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡。使用Cytoscape插件“cytoHubba”鑒定關鍵基因，對排名前10位的節(jié)點進行下一步分析。利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建circRNA-miRNA-hub基因網(wǎng)絡。整個研究過程的平臺流程見圖1。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0.1軟件進行數(shù)據(jù)分析及繪圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 研究過程流程圖

2 結(jié) 果

2.1 circRNAs的差異表達 整個研究過程的流程見圖1?？偣驳玫?5個DECs，其中21個circRNAs表達上調(diào)，34個circRNAs表達下調(diào)。見表1。

表1 circRNAs的差異表達情況

續(xù)表1

2.2 circRNA和miRNA間的相互作用 利用Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫預測DECs相關的靶miRNA，得到716個miRNAs。結(jié)果表明DECs可以調(diào)控大量的靶miRNAs，其中3個DECs的靶miRNAs的頻率最高，分別是hsa-miR-1184、hsa-miR-1205和hsa-miR-1236。

2.3 重疊的miRNAs及相關的DECs HMDD數(shù)據(jù)庫中包含多種與疾病相關的miRNAs，并已經(jīng)通過實驗驗證。我們在HMDD數(shù)據(jù)庫中獲得73個與房顫相關的miRNAs，再使用Venny 2.1.0得到其與靶miRNAs的交集(圖2)，共有8個重疊miRNAs與13個DECs相關(表2)。

注：藍色表示DECs預測靶miRNAs，黃色代表與房顫相關的miRNAs，兩圓圈的交集代表重疊的miRNAs，右側(cè)框中是重疊miRNAs的名稱

表2 重疊的miRNAs及相關的DECs

2.4 相關DECs RT-PCR檢測 通過 circBase 網(wǎng)站(http://www.circbase.org/)獲取circRNAs序列，將序列頭尾相接，使用 NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設計引物(表3)，擴增產(chǎn)物須包含環(huán)化位點，以ACTB為內(nèi)參，計算30例CABG患者相關DECs的相對表達量，隨后對數(shù)據(jù)進行標準化處理。結(jié)果顯示，與非房顫患者組相比，房顫患者組相關DECs表達差異明顯，并且結(jié)果與預測結(jié)果一致(圖3)，符合預期。

表3 qRT-PCR引物序列

圖3 相關circRNA RT-PCR檢測

2.5 circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建 在3個不同miRNA靶數(shù)據(jù)庫中，有5個重疊的miRNAs(hsa-miR-142、hsa-miR-144、hsa-miR-183、hsa-miR-223和hsa-miR-574)具有相同的靶標mRNA。然后，我們得到了6個DECs、5個重疊miRNAs和204個靶mRNAs，再使用“cytoHubba”插件鑒定了前10個hub基因?；?個circRNAs、5個miRNAs和10個hub基因構(gòu)建了一個circRNA-miRNA-hub基因網(wǎng)絡。利用Cytoscape對circRNA-miRNA-hub基因網(wǎng)絡進行了可視化分析(圖4)。

圖4 circRNA-miRNA-hub基因網(wǎng)絡

3 討 論

CABG患者住院期間POAF的發(fā)生率為20%～50%，尋找具有預測價值的生物標記物可以使患者獲得有益的心臟外科護理，并且能進一步開展個性化治療策略，如預防性干預和加強監(jiān)控等，可以最大限度地降低患者發(fā)生POAF的風險[20]。circRNA非常穩(wěn)定，可以避免其外切酶和去分支酶的影響[21]。因此，circRNA在識別患者POAF風險方面具有獨特的優(yōu)勢。研究[22]顯示circRNA與多種疾病有關，如冠狀動脈疾病、多發(fā)性硬化、類風濕關節(jié)炎、癌癥等。一些學者也在CABG術后患者的血漿及血漿外泌體中發(fā)現(xiàn)了大量DECs，表明circRNA可能在POAF的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20-22]。

本研究中，我們用Circular RNA Interactome數(shù)據(jù)庫預測circRNAs的靶miRNA，miRNA結(jié)合的DECs越多，越有可能參與POAF的發(fā)病機制，這些DECs的靶miRNAs中頻率最高的3個miRNAs分別是hsa-miR-1184、hsa-miR-1205、hsa-miR-1236。以往的研究中，這3個miRNAs主要與癌癥相關[23-25]，而本研究發(fā)現(xiàn)它們與POAF的關系。miRNAs是一類約有22個核苷酸的單鏈非編碼RNA，在進化上高度保守[26]。miRNAs與癌癥、糖尿病、心臟病和自身免疫性疾病等有關[27-28]。研究表明，miRNA-483-5p、miRNA-29a、miRNA-23a、miRNA-26a、miRNA-199a、miRNA-1和miRNA-133a等miRNAs被用作CABG患者POAF風險的潛在預測因子[20]。同時，這些miRNAs也被收集到HMDD數(shù)據(jù)庫中作為房顫相關的miRNA。

根據(jù)以往研究，在隨訪中發(fā)現(xiàn)POAF患者更傾向于發(fā)生房顫[29]，提示POAF的發(fā)生與原發(fā)性房顫密切相關。因此，我們從HMDD數(shù)據(jù)庫中選擇73個房顫相關miRNAs，如果DECs與已報道的房顫相關miRNAs相互作用，則它們更有可能與POAF相關。本研究得到13個DECs與8個房顫相關的miRNAs作用，我們預測了這8個miRNAs的靶mRNA，在3個不同miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫中，只有5個miRNAs具有相同的靶基因。最后，我們獲得了一個circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡，其由6個DECs、5個重疊miRNAs和204個靶mRNAs組成。接著，我們構(gòu)建了circRNA-miRNA-hub基因網(wǎng)絡，使用“cytoHubba”插件識別出前10個hub基因(圖4)，其中WASL、ECT2、ITGB1和EZR參與癌細胞的遷移和侵襲[29-32]，與癌癥有關。據(jù)報道，TORTV相關的ACTN4/CAPN12單核苷酸多態(tài)性與冠狀動脈疾病、心率和房顫有關[33]。RAC1已被證實可增強心房重構(gòu)和心房纖維化，抑制RAC1活性有助于抑制房顫的進展[34-36]。有報道稱RHOA-ROCK信號通路與人類心臟疾病密切相關，而ROCK抑制可導致不成熟的靜脈竇心肌，包括竇房結(jié)和左側(cè)靜脈竇起搏器表型的異位維持[37]。Chen等[38]研究發(fā)現(xiàn)房顫患者的左心房細胞中ROCK1和ROCK2的表達明顯高于正常人，并且ROCK2、ROCK1可能參與房顫患者的左心房細胞的肌溶解，進而導致心房擴大。Düzen等[39]研究發(fā)現(xiàn)房顫患者白細胞基因RHOC、RHOH、RAC3、RHOB、ROCK1、ROCK2表達明顯升高，提示白細胞RHO/ROCK基因表達可能通過激活免疫或炎癥級聯(lián)反應參與非瓣膜性房顫的發(fā)病機制。

對于6個DECs，目前還沒有研究報道其與POAF有關。Slagsvold等[40]利用心臟手術后房顫患者和正常心律患者的心耳組織來探索線粒體功能和miRNA之間的關系,發(fā)現(xiàn)房顫患者中miR-144的表達顯著上調(diào)，房顫患者心耳組織的最大線粒體呼吸率均增加。這提示線粒體功能和miRNA，包括miR-144和miR-486都參與了房顫的病理生理過程。王堅剛等[41]利用微陣列芯片和RT-PCR法來鑒定房顫相關的miRNA表達譜及其靶基因，發(fā)現(xiàn)房顫患者中miR-142、miR-223、miR-146b和miR-486明顯過表達，其中miR-142和miR-486的表達上調(diào)超過2倍。Liu等[42]用同樣的方法來分析二尖瓣置換術患者的左心耳組織miRNA的表達水平,發(fā)現(xiàn)miR-574在竇性節(jié)律者和房顫患者之間表達量差異顯著，miR-574可能參與了與房顫相關的幾個重要功能通路(如mTOR、Wnt和Notch信號通路)，為房顫的分子機制提供了新的線索，并揭示了心臟手術患者房顫相關miRNAs的表達與POAF進展之間的潛在聯(lián)系。因此，我們推測DECs通過吸附miRNAs，進而調(diào)控與房顫進展相關的靶基因的表達，從而在POAF中發(fā)揮作用。我們的研究結(jié)果為POAF發(fā)病機制提供了新思路，并值得更深入的探索。

綜上所述，POAF發(fā)生的機制可能與circRNA和miRNA的失調(diào)密切相關，circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡特異性參與調(diào)控多種通路和細胞分子生物學過程。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)了可能用于預測POAF的血漿circRNA生物標志物，為POAF的發(fā)病機制提供了新的線索，對POAF患者的診斷、治療和預后有一定的指導意義。