低溫貯藏對草莓苗的生理變化及生長發(fā)育的影響

于紅梅，袁華招，關 玲，陳曉東，唐山遠，王慶蓮，趙密珍

（1江蘇省農業(yè)科學院果樹研究所，江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京210014；2句容市白兔草莓研究院，江蘇鎮(zhèn)江212403）

0 引言

草莓(Fragaria ananassaDuch)屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其色澤艷麗，風味獨特，營養(yǎng)豐富，素有“水果皇后”之美譽[1]。因其種植周期短、見效快、經濟效益高、適應性強，已成為中國一些農村地區(qū)的經濟支柱。據中國園藝學會草莓分會統(tǒng)計，2018年中國草莓總面積超17萬hm2，總產量500萬t，在所有農作物中草莓的增幅位居前茅，已成為世界第一草莓生產大國和第一消費大國，占世界總產量的50%以上[2-4]。“小草莓，大產業(yè)”，隨著草莓鮮果產業(yè)不斷蓬勃發(fā)展壯大，育苗產業(yè)的快速興起，市場對草莓鮮果和種苗提出了耐儲運、損耗小、質量更優(yōu)的新要求。

“見苗三分收”，種苗質量是草莓安全優(yōu)質生產的基礎，而運輸種苗對整個產業(yè)的發(fā)展也是至關重要的。最近幾年，隨著物流運輸業(yè)的快速發(fā)展和草莓經濟效益的穩(wěn)定提高，專業(yè)化異地育苗加速了進程，并呈快速擴大態(tài)勢。專業(yè)苗圃向云貴川和東北等夏季冷涼地區(qū)轉移，育苗環(huán)境得到了改善，種苗質量得到了保證，但長距離運輸帶來了種苗發(fā)熱、脫水等生理脅迫問題。另外，草莓設施栽培定植時間比較集中，在8月下旬到9月中旬市場對種苗需求量大，短時間供需難以平衡，也制約草莓育苗產業(yè)的發(fā)展[5-6]。為緩解種苗供需不平衡和運輸途中技術障礙，目前在草莓苗貯藏技術方面開展了對草莓生長發(fā)育及果實性狀的穴盤苗變溫補光、低溫保濕等應用研究[7-8]，及低溫脅迫對種苗生理指標變化的保護機制[9-10]，但未能將低溫貯藏期生理變化對種苗質量、定植移栽后物候期以及產量的影響有機結合。本試驗探索草莓裸根苗低溫貯藏的生理變化以及經過長時間冷藏后對后期生長發(fā)育產量的影響，旨在為草莓裸根苗冷藏和運輸技術提供參考，利于建立草莓種苗冷藏和運輸體系。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與設計

1.1.1 供試材料 試驗于2017年8月下旬—12月下旬在江蘇省農業(yè)科學院溧水植物基地和江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室進行。供試草莓品種為‘寧玉’，采用大田土壤繁殖的匍匐莖子苗，去掉子苗根部的泥土，篩選出長勢一致、大小相近的子苗作為供試驗種苗。

1.1.2 材料處理 將篩選出的600株種苗分成3組，于起苗當天將根部泥水保濕置于泡沫盒密封，并于5℃低溫冷庫貯藏。

1.1.3 試驗設計

試驗Ⅰ：低溫貯藏條件下草莓裸根苗的生理變化。分別于貯藏后1、3、8、14、21天取10株草莓種苗的根和葉，用液氮處理置-80℃保存，重復3次，測定根和葉的生理和激素指標。

試驗Ⅱ：低溫貯藏后對草莓裸根苗的物候期以及生長發(fā)育的影響。分別于貯藏后1、3、8、14、21天取20株草莓種苗移栽定植大棚，重復3次，調查物候期和統(tǒng)計產量。

1.1.4 栽培管理 每條高架定植試驗草莓種苗2行，行距20 cm、株距15 cm。栽種時選用生長一致3葉以上的種苗，定植后連續(xù)微噴保濕促活。試驗高架管理方法與其他高架一致。

1.2 指標測定

1.2.1 生理生化指標 種苗生理生化指標試驗總超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性以及可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛(MDA)和葉綠素含量均采用紫外分光光度法測定[11-13]。每生物學重復均稱取草莓待測組織約0.5 g放于研缽中研磨，具體提取方法及酶活力的測定方法參照南京建成生物工程研究所(www.njjcbio.com)生產的保護酶活力測定試劑盒說明書。

1.2.2 內源激素測定 稱取液氮中研磨待測組織約0.1 g于5 mL離心管，加入1 mL提取液（2-丙醇：H2O:HCL=2:1:0.002），4℃條件下，震蕩提取30 min，再加入2 mL二氯甲烷震蕩提萃取30 min，然后13000 r/min離心5 min。取下清液2 mL到棕色玻璃管中，氮氣吹（不完全吹干），然后用200μL甲醇溶解，0.22μm過濾，采用Agilent Technologies LC-MS 6490型檢測。液相條件：色譜柱型號Agilent Poroshell 120 EC-C18，流動相為超純水(H2O)和乙腈(MeOH)，洗脫梯度如表1所示，進樣量5μL，檢測波長254 nm，外標法；質譜條件：正離子模式，補償電壓為4 kV，氣壓為45 psi，溫度為350℃，透鏡電壓為135 V。

表1 HPLC洗脫梯度

1.2.3 物候期及產量 根據《草莓種質資源描述規(guī)范和數據標準》調查物候期，并統(tǒng)計各處理草莓產量。

2 結果與分析

2.1 低溫貯藏條件下草莓裸根苗根和葉的生理變化

2.1.1 對草莓種苗葉綠素含量的影響 葉綠素是植物光合作用的重要場所，檢測葉綠素含量的多少可從側面說明低溫、無光環(huán)境是否適宜貯藏草莓裸根苗。由圖1可知，在同樣低溫條件下，隨著貯藏時間的延長，‘寧玉’草莓葉片葉綠素a，葉綠素b含量以及葉綠素a/b比值均呈現降低趨勢。葉綠素a前8天含量下降緩慢，幅度0.09 mg/g，8天后下降速度有所加快，幅度0.28 mg/g；葉綠素b始終緩慢下降，前后速度變化不大，幅度只有0.10 mg/g；而葉綠素a/b比值雖有下降趨勢，但比值始終在2以上。說明5℃低溫、無光的環(huán)境一方面降低種苗呼吸，減少能耗，也可能激發(fā)生理活性保護種苗從而延長種苗保存時間。

圖1 低溫貯藏時間對草莓種苗葉綠素的影響

2.1.2 對草莓種苗保護酶活性的影響 抗氧化系統(tǒng)SOD和POD是植物防御系統(tǒng)重要的保護酶，反映植物氧化代謝水平的高低，其酶的活性高有利于保持植物細胞結構的完整性，可以提高細胞對不良環(huán)境抗性的作用。低溫貯藏后草莓植株葉片和根系總SOD活性總體表現為下降（圖2A、B），POD活性表現為上升（圖2D）；而在相同貯藏時間下表現出葉片中總SOD明顯低于根系（圖2C），而POD截然相反，表現為根系明顯低于葉片（圖2D）；從貯藏到結束，葉片中總SOD下降46.52%，其中8天下降幅度最大18.08%，POD上升幅度40.13%，8天后上升幅度明顯緩慢；根系中總SOD下降14.68%，POD上升428.73%。以上結果說明低溫貯藏脅迫草莓植株，體內SOD和POD活性應急改變以提高抵御低溫逆境的能力。

圖2 低溫貯藏時間對草莓種苗保護酶活性的影響

2.1.3 對草莓種苗滲透調節(jié)物質及丙二醛含量的影響MDA是膜脂過氧化的主要最終產物，常被作為判斷膜脂過氧化作用的一個主要指標，其含量的高低反映了膜系統(tǒng)受害的水平。低溫貯藏后草莓植株MDA含量的影響由圖3，A可知，葉片的MDA含量始終高于根系，且隨著低溫脅迫時間的延長，表現先降低后升高波動趨勢，1～3天短時間低溫貯藏，MDA明顯下降18.45%，之后MDA有所升高，8天再次出現峰值達89.82%，在整個低溫貯藏過程中，葉片的MDA始終是降低的，21天貯藏結束降至88.85%。而根系的MDA含量表現為先升高后降低，變化趨勢與葉片基本一致，但反應滯后于葉片，說明MDA在低溫貯藏過程中抵御脅迫，發(fā)揮保護作用。

圖3 低溫貯藏時間對草莓種苗滲透調節(jié)物質及丙二醛(MDA)的影響

圖3B顯示，在低溫貯藏過程中草莓植株根系的滲透調節(jié)物質脯氨酸、可溶性糖含量均發(fā)生不同程度的變化。脯氨酸表現為先升高后下降，3天出現峰值達到250.12%，在下降的過程中，3～8天下降幅度較大104.57%，8天后平穩(wěn)下降至結束，21天脯氨酸含量117.57%。在受到低溫脅迫后，可溶性糖含量前期隨貯藏時間的延長而呈現降低趨勢，結束時有所反彈。以上結果說明在低溫貯藏的脅迫下，脯氨酸積極發(fā)揮調節(jié)胞質和液泡之間的滲透液的平衡功能，前期快速積累保護可溶糖等滲透脅迫的細胞結構，穩(wěn)定細胞膜完整性，提高植株抗逆能力。

2.2 低溫貯藏條件下草莓裸根苗短縮莖的內源激素變化

內源激素是植物體內產生的一些微量而能調節(jié)自身生理過程的有機化合物，如IAA、ABA、GA3對植物的生長發(fā)育有重要的調控作用。圖4A結果顯示IAA先降低在升高，1～3天急速下降，8天出現峰谷，下降了60.1%；ABA結果顯示低溫貯藏變化趨勢與IAA剛好相反（圖4B），3天急速上升，8天出現峰值，增加了11.63倍；觀察圖4C發(fā)現GA3變化與IAA前期表現一致，不同的是前期下降速度緩慢，3～14天之間變化幅度較大，且隨著低溫貯藏時間的延長后期又下降。以上結果說明植株在受到低溫脅迫時，啟動IAA、ABA、GA3抗寒物質生成，調節(jié)代謝對抗低溫，維持細胞膜結構功能，使種苗安全休眠。

圖4 低溫貯藏時間對草莓內源激素IAA、ABA和GA3的影響

2.3 低溫貯藏后對草莓裸根苗物候期生長發(fā)育的影響

2.3.1 低溫貯藏后對草莓物候期的影響 從表2可以看出，與低溫貯藏1天相比，3天對草莓物候沒有影響，但定植期可以晚2天；貯藏8天定植期推遲7天，顯蕾期推遲3天，盛花期推遲1天，始熟期推遲4天，說明從定植到顯蕾期縮短了4天、盛花期縮短了6天，始熟期提早了3天；而低溫貯藏14～21天則表現為，從定植到顯蕾期縮短了5～9天、盛花期縮短了0～3天，始熟期推遲了4～6天。以上結果表明，低溫貯藏不同程度地促進草莓花芽分化進程，明顯縮短定植到盛花期的間隔時間，且低溫處理小于8天始熟期可以提早，大于14天始熟期推遲。

表2 低溫貯藏時間對草莓物候的影響

2.3.2 低溫貯藏后對草莓產量的影響 從表3可知，低溫貯藏前1～8天各處理單株總產量差異不大，14～21天各處理也沒有明顯差異，但8天前后2個階段的總產量存在顯著差異，其中冷藏3天總產量最高331.25 g，14天總產量最低269.79 g。觀察各個單月產量發(fā)現，12月份之前，處理1天的產量顯著高于其他處理，且低溫處理時間短有單株產量高的趨勢；1—2月份單月產量表現為先升高降低再升高的趨勢，低溫處理8天出現峰值后，21天產量再次峰值；再統(tǒng)計比較發(fā)現，3月份之前低溫處理8天產量最高，合計231.36 g，與處理小于3天相差35.09～37.16 g，說明8天低溫利于提高草莓早期產量。

表3 低溫貯藏時間對草莓產量的影響

3 討論

不同貯藏條件是影響草莓苗儲存質量最重要的環(huán)境因子，直接影響著草莓苗植株體內一切生理變化，也是影響草莓移栽定植、生長發(fā)育等最基本的要素[14-17]。低溫是抑制草莓苗呼吸生長采用的常規(guī)技術手段，也是促進草莓花芽分化技術措施之一[18-19]。在自然狀態(tài)下，生產上莓農通常就近起苗及時定植，或者12℃短時間預冷，加冰塊裝箱遠距離運輸發(fā)苗，時間控制在48 h之內。本研究在低溫5℃無光照情況下，研究貯藏期間草莓苗的生理變化以及經過長時間冷藏后對后期生長發(fā)育等指標，擬建立草莓種苗冷藏和運輸體系。試驗結果表明‘寧玉’草莓葉片葉綠素a，葉綠素b含量以及葉綠素a/b比值均呈現降低趨勢，而葉綠素a/b比值始終在2以上，初步說明5℃低溫，無光照環(huán)境可以安全貯藏草莓苗，本試驗雖然沒有直接得出在低溫5℃下光照強弱對葉綠素影響不大的結論，但驗證了2009年張廣華[20]研究的結論，進一步明確溫度在低溫貯藏過程中的主導作用，同時引起其他生理指標發(fā)生變化。低溫貯藏后草莓苗葉片和根系的SOD和POD活性發(fā)生了變化，SOD活性總體下降，POD活性總體上升，與2015年何雨溈[21]研究在4℃低溫條件下結果一致；本試驗還發(fā)現低溫貯藏前8天SOD和POD活性變化幅度較大，筆者沒有查到相關文獻，推測草莓根系泥水保濕8天，前期抵御外界脅迫依靠自身儲存的能量，后期植株根系開始萌動參與抵御低溫脅迫；另外葉片、根系中的SOD和POD活性含量不同，一方面保護酶自身是對溫度敏感性不同，另一方面植株不同部位細胞結構存在區(qū)別。比如，MDA也是葉片中含量始終高于根系，在整個低溫貯藏過程中，葉片中的丙二醛始終降低，變化趨勢表現先降低后升高，第8天出現峰值達89.82%，21天貯藏結束降至88.85%；而根系中的MDA變化趨勢表現為先升高，14天降低至峰谷，本研究得出二者變化趨勢基本一致結論是基于根系低溫接觸面小于葉片，機制反應滯后所致；在抵御低溫脅迫的過程中丙二醛變化趨勢有波動，說明MDA作為判斷膜脂過氧化作用的主要指標，影響脯氨酸、可溶性糖等滲透物質的代謝反應。2015年林建忠[9]研究結果表明低溫脅迫可溶性糖在8 h峰值后開始下降；2019年白春雷[22]研究利用低溫鍛煉的方式對草莓進行處理，結果表明可溶性糖在24 h峰值后下降，但含量始終是增加的結論一致；與此同時，白春雷研究還表明脯氨酸也在24 h呈現出降低的態(tài)勢，但總體含量升高。本文以第1天貯藏指標為參照，結果表明根系中的可溶性糖含量表現下降趨勢至14天達峰谷，后期有所反彈；而脯氨酸表現為先升高，3天后達到峰值后下降，分析數據發(fā)現丙二醛與可溶性糖同時在14天處于峰谷，驗證了丙二醛將體內儲存的淀粉轉化為糖相關性；脯氨酸是植物蛋白質的組分之一，廣泛存在于植物體中，與可溶性糖等滲透物質等聯合發(fā)揮調節(jié)胞質和液泡之間的滲透液的平衡功能，穩(wěn)定細胞膜完整性，提高植株抗逆能力。

植物休眠一般認為受控于赤霉素、生長素類促進物質與脫落酸類抑制物質相互作用，也是對草莓低溫脅迫起應答反應，其內源激素IAA、GA3和ABA也會發(fā)生變化[10,15]。一方面，細胞中IAA、GA3含量降低，抑制草莓植株生長，促進氣孔關閉，降低蒸騰和呼吸作用，并維持較高的葉綠素、可溶性糖和脯氨酸含量等以適應環(huán)境；另一方面，細胞中ABA迅速積累減弱草莓植株體內滲透物質的合成，并調節(jié)ABA、GA3、IAA平衡以發(fā)揮抵御低溫的調節(jié)效應。本研究中，前8天促進物質類赤霉素GA3、生長素IAA明顯降低，抑制物質類脫落酸ABA迅速上升，這與前人對草莓內源激素[10,15]應答低溫相應研究結果一致；而8天后內源激素變化可能與草莓植株體內后期生理代謝調節(jié)物質控制密切相關。

低溫貯藏不同時間引起草莓裸根苗的生理、內源激素發(fā)生變化，也會間接影響物候和產量。本研究結果表明低溫貯藏不同程度地可以促進草莓花芽分化進程，縮短定植到盛花期的間隔時間，且低溫處理小于8天始熟期可以提早，單株總產量差異不大，而低溫處理大于14天始熟期推遲，總產量顯著下降。如果同時定植不同冷藏時間的草莓種苗，是否得到相同結論有待進一步研究。筆者分析處理8天，定植時間是9月7日，外界自然溫度適合草莓生長發(fā)育，利于花芽順利分化；而低溫貯藏14天，隨著外界溫度降低，定植時間的延后，草莓生長發(fā)育開始緩慢，期物候間隔拉長、成熟期推遲，同時期的產量也顯著降低。

4 結論

筆者認為種苗體內生理指標和內源激素IAA、GA3、ABA相互協(xié)作，在低溫脅迫過程中都起著重要的調控作用。雖然作用機理十分復雜，但都調節(jié)自身含量應對低溫脅迫從而提高適應能力。本研究結果表明5℃低溫可以安全貯藏草莓裸根苗。冷藏小于8天可以促進花芽分化，縮短物候之間時間，減少果實發(fā)育天數，4月之前單株總產量高于322.74 g，顯著高于大于14天處理。建議生產上根據最佳定植時間，種苗低溫貯藏運輸時間控制在8天以內較為安全。