纖維素降解菌的研究與應(yīng)用進展

章沙沙，徐健峰，柳增善*

1.吉林大學(xué) 人獸共患病研究所教育部重點實驗室/動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062；2.盤錦檢驗檢測中心/盤錦市疾病預(yù)防控制中心,盤錦 124010

近年來，全球的環(huán)境污染和能源危機威脅著人類的可持續(xù)發(fā)展，同時也刺激了社會對可再生資源的利用需求[1]。我國提出到2025年，利用可再生資源實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)生物乙醇，爭取達到國際領(lǐng)先技術(shù)水平。纖維素降解菌分泌的纖維素酶在世界工業(yè)酶市場居第三位，占工業(yè)酶需求總量的8%～10%，預(yù)計纖維素酶每年銷售量近4-5億美元[2]。美國諾維信公司是最早研發(fā)生產(chǎn)纖維素酶制劑的公司，從2009年—2012年連續(xù)三年推出復(fù)合纖維素酶Cellic CTec1代、2代、3代。與此同時，美國杜邦公司推出首款纖維素轉(zhuǎn)化商用酶Accellerase1000，之后又陸續(xù)推出1500、DUET、TRIO等Accellerase系列產(chǎn)品[3]。纖維素酶在食品、紡織品、動物飼料、生物燃料、清潔產(chǎn)品、造紙業(yè)等其他市場有普遍應(yīng)用。本文針對纖維素降解菌的種類及在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的實際應(yīng)用進行了論述，為進一步探索纖維素降解菌未來研究方向作了展望。

1 纖維素降解菌的研究進展

在自然環(huán)境中，許多微生物都能夠降解纖維素。已發(fā)現(xiàn)的能夠有效降解纖維素的微生物種類有200種以上，其來源非常廣泛，在反芻動物胃腸道和某些昆蟲體內(nèi)也能分離到纖維素降解菌。表1為目前已知能產(chǎn)生纖維素降解作用的主要菌株，分為三大類：細菌、真菌、放線菌，其中以真菌種類居多，且應(yīng)用最為廣泛。

1.1 纖維素降解菌

1.1.1真菌

真菌降解纖維素的能力強、產(chǎn)酶量大，是研究最深入的纖維素降解菌。木霉屬、曲霉屬和青霉屬是纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)的主要酶源，目前工業(yè)級水解酶活性較高的代表菌種為里氏木霉、康氏木霉和黑曲霉[4]。地霉菌和煙曲霉是堆肥底物中的主要菌群，橙色嗜熱子囊菌、擔(dān)子菌等也具有較強的分解纖維素的能力。劉清鋒等[5]從秸稈中分離到1株分解纖維素能力較強的青霉菌T24-2。測定最佳CMC酶活為45.01 IU/mL和濾紙酶活為6.89 IU/mL。T24-2降解稻草粉后糖化率可達40.17%，說明該菌在秸稈利用上具有良好的應(yīng)用前景。智利科學(xué)家CARRASCO M[6]等人從南極亞地區(qū)的土壤樣品中分離出22種耐寒酵母，在較寬的溫度范圍(4 ℃～30 ℃)中檢測到不同程度的纖維素。ATHIRARAJ S R[7]等人利用金絲桔梗通過微紫青霉菌NCIM1366替代里氏木霉生產(chǎn)生物乙醇。NCIM1366所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活高出里氏木霉近十倍，同時NCIM1366向細胞外培養(yǎng)基分泌更多的蛋白質(zhì)，濃度比里氏木霉高1.8倍酶活性。孫芹英等[8]將白腐菌混合發(fā)酵用于降解秸稈，為秸稈類廢物資源提供了新的途徑。JAIN L[9]通過甘蔗渣糖化與Alaromycesverruculosus(一種海洋真菌)IIPC324固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，通過優(yōu)化發(fā)酵條件將其應(yīng)用于生產(chǎn)生物燃料。曹慧[10]等從青藏高原土壤中篩選出低溫纖維素降解菌株釘斑鏈霉菌LD19，LD19可同時分泌半纖維素酶和低溫纖維素酶，在飼用工業(yè)中具有較大應(yīng)用潛力。

表1 纖維素降解菌種類及應(yīng)用領(lǐng)域

1.1.2細菌

在自然界中，真菌通常比細菌產(chǎn)生更多的纖維素酶，但由于真菌所產(chǎn)酶大多為耐酸纖維素酶，在某些工業(yè)化條件下制約了其生產(chǎn)。此外，與真菌相比，細菌生長快速，容易獲得較高的酶產(chǎn)量，因此在生產(chǎn)應(yīng)用上就具有較高現(xiàn)實意義。細菌所產(chǎn)纖維素酶一般為細胞表面酶，分解纖維素時細菌附著在纖維素表面，向內(nèi)部增生，在接觸點處纖維素被細菌破壞后溶解[11]。PRAMANIK S K[12]等將假蕈狀芽孢桿菌與甘蔗渣為原料共同發(fā)酵用于生產(chǎn)纖維素酶，并分析了所產(chǎn)纖維素酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，為進一步探索芽孢桿菌中纖維素酶和纖維素相互作用的動力學(xué)提供依據(jù)。蔡興旺等[13]和孔雅麗等[14]分別從堆肥和土壤中分離篩選出纖維素酶高產(chǎn)菌株，纖維單孢菌D1和芽孢桿菌X3-2，并同時研究了最適產(chǎn)酶條件。劉占英等[15]從反芻動物體內(nèi)中篩選出4株細菌，纖維素降解率均能達到20%以上。ZHANG Z Y[16]等人從甲蟲的腸道中分離出韋氏芽孢桿菌ZY-1-1，對其基因組的完整分析發(fā)現(xiàn)在預(yù)測的3688個蛋白質(zhì)編碼基因中有24個基因參與纖維素的降解，這將有助于纖維素生物降解的機理以及新型纖維素分解細菌的生物技術(shù)應(yīng)用。日本研究學(xué)者YUYA T[17]分別比較了3種纖維單胞菌(糞氏、重氮和產(chǎn)黃)對纖維素的降解效果，發(fā)現(xiàn)糞氏纖維單胞菌降解效果最好，4 d內(nèi)可降解2.5 g/L的纖維素，研究結(jié)果表明該菌是新型微生物燃料電池的極佳候選者。本實驗室中從反芻動物的血液、腸道和糞便中分離得到6株纖維素酶活較高的細菌，經(jīng)鑒定分別為1株纖維單胞菌屬和5株纖維微細菌屬，并將其用于環(huán)保領(lǐng)域(降解廢水污水)和生物醫(yī)療領(lǐng)域(轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷)的研究，均取得了一定進展[18]。

1.1.3放線菌

研究表明，放線菌是一類蘊含巨大實用價值的微生物，并且大多數(shù)放線菌在高溫和強堿性條件下仍能保持較高活性，可以產(chǎn)生大量的生物酶，可以添加到飼料中抑制腸道內(nèi)有害菌的生長，還可以降低飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料的利用率[19]。用放線菌制成的微生物發(fā)酵菌劑具有極好的應(yīng)用價值，如 CHELLAPANDIP[20]等從花園土壤中分離出的26種鏈霉菌，其中巴西鏈霉菌的天然菌株在深層發(fā)酵中生產(chǎn)高產(chǎn)量的內(nèi)切葡聚糖酶，被認為在食品和紡織工業(yè)中有效利用的候選菌株。魏越波[19]獲得一株耐高溫產(chǎn)酶放線菌嗜熱鏈球菌Fx-1, Fx-1可耐60 ℃的高溫, 當(dāng)pH為7.0，含水量為40%的物料中培養(yǎng)為最適生長條件，該菌株可為篩選發(fā)酵飼料耐高溫菌株提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。WANG C[21]等人從堆肥放線菌的16Spyrotag庫發(fā)現(xiàn)的放線菌群擁有大約46.1%的纖維素酶基因，它們屬于纖維二糖水解酶，β-葡萄糖苷酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，木質(zhì)素酶基因，這一研究結(jié)果有望應(yīng)用于能源領(lǐng)域用于生產(chǎn)生物燃料。

1.2 纖維素降解菌基因工程菌的構(gòu)建

通過基因組學(xué)技術(shù)以及代謝工程途徑從各種纖維素降解菌中獲得的新型纖維素酶基因的使用將在工業(yè)生產(chǎn)中提高高產(chǎn)纖維素酶來源。1982年WHITTLE D J[22]等人首次克隆出糞纖維擔(dān)胞菌的纖維素酶基因，迄今為止，研究學(xué)者已從細菌和真菌中克隆并測序出80多種纖維素酶基因。LIU H[23]為了將纖維素生物質(zhì)有效地轉(zhuǎn)化為生物乙醇燃料，他們利用基因工程技術(shù)改造了幾株酵母菌，進行基因修飾后表達了重組纖維素酶。SONG Y H等人[24]用黑山羊瘤胃構(gòu)建嗜熱纖維素酶的宏基因組文庫，發(fā)現(xiàn)GH74的KG37基因與兩個琥珀酸纖維桿菌內(nèi)切1,4-β-葡聚糖酶有77%的相似性。在大腸桿菌中過表達后重組纖維素酶在高達50 ℃的溫度下表現(xiàn)出活性和熱穩(wěn)定性，可用于將纖維素轉(zhuǎn)化為工業(yè)產(chǎn)品。HEGAZY W K[25]構(gòu)建一種有效降解纖維素的新型重組菌株。從枯草芽孢桿菌BTN7A菌株中克隆了內(nèi)切葡聚糖酶基因(bgls)，將獲得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中成功高效表達該基因。新構(gòu)建克隆株產(chǎn)酶率比原菌株高得多。LIU Z[26]成功的構(gòu)建了纖維素啤酒酵母產(chǎn)纖維素酶工程菌，該菌不但可以直接用于從稻草中生產(chǎn)乙醇，同時酶用量減少了40%，使生產(chǎn)纖維素生物燃料的可行性大大提高。由于真菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性低，基因組中編碼纖維素降解酶的基因數(shù)量較少，導(dǎo)致其酶系組成不夠齊全。美國陸軍軍需研發(fā)中心將里氏木霉經(jīng)誘導(dǎo)突變并改造遺傳密碼，開發(fā)出高活力纖維素酶基因工程菌株，酶系包含β-1,4-葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶，現(xiàn)已成為美國幾家酶制劑大公司應(yīng)用最廣泛的纖維素酶生產(chǎn)菌。

2 纖維素降解菌應(yīng)用研究

2.1 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，每年可產(chǎn)出數(shù)百萬噸的農(nóng)作物秸稈和纖維素廢棄物，對農(nóng)業(yè)廢棄物的合理處理是環(huán)保領(lǐng)域亟待解決關(guān)鍵問題之一。纖維素作為一種廣泛存在的可再生資源，如果能夠轉(zhuǎn)化為有用的資源，對于農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展有極大的價值。研究表明，纖維素降解菌可增強土壤降解秸稈的能力，木霉菌、白腐菌可降解幾乎所有的木質(zhì)纖維素，這對于農(nóng)作物廢棄物處理具有十分重要的意義[27]。如美國的杜邦公司出品的纖維素轉(zhuǎn)化商用酶Accellerase TRIO就成功地應(yīng)用于玉米秸稈、小麥秸稈和甘蔗渣等不同種類的木質(zhì)纖維素原料[28]。LI J等[29]從藏牛瘤胃中分離和鑒定出2株纖維素分解細菌，木薯腸球菌JFL12和糞腸球JF85，將它們與植物乳桿菌共同處理青貯飼料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有更高的葡萄糖產(chǎn)量和纖維素可轉(zhuǎn)化性，可加速結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解并改善青貯飼料的質(zhì)量，可作為提高青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量的候選菌株。ZHOU X L[30]等人分離出粘細菌LPMO10B分泌的胞外酶可降低農(nóng)作物秸稈纖維素的聚合度，并與商業(yè)纖維素酶協(xié)同作用以促進糖化反應(yīng)。用商業(yè)纖維素酶與ViLPMO10B以9∶1比例混合，玉米秸稈，甘蔗渣和稻草轉(zhuǎn)化為還原糖的轉(zhuǎn)化效率分別提高了17%，16%和22%,結(jié)果表明ViLPMO10B在農(nóng)業(yè)殘留物處理中具有應(yīng)用價值。雖然有較多的菌種資源可以利用，但總體上降解效率較低，需要改造或優(yōu)化條件，才能增加利用效率。

2.2 工業(yè)領(lǐng)域

2.2.1能源生產(chǎn)領(lǐng)域

2020年12月，中國發(fā)布《新時代的中國能源發(fā)展》白皮書中指出，中國能源生產(chǎn)和利用方式將發(fā)生重大變革，提倡與國際合作共同推進能源綠色轉(zhuǎn)型。將農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的秸稈等纖維廢棄物、工業(yè)生產(chǎn)過程中纖維廢渣和生活工作中高纖維素類廢紙物質(zhì)通過纖維素降解菌變成生產(chǎn)乙醇的主要原料，成本低，利用率高，可以將再生的纖維素材料轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)乙醇[31]。美國Novozyme公司成功的將纖維素酶生產(chǎn)酒精的成本減低30倍，這一成果使得其與利用淀粉生產(chǎn)酒精的成本持平。同時成本的降低使燃料酒精的價格和汽油相差無幾。另外在美國能源部的網(wǎng)站上也有關(guān)于玉米秸桿等纖維質(zhì)資源的生產(chǎn)清潔燃料酒精的詳細介紹。美國多家公司合作將玉米中的纖維素、木糖等物質(zhì)全部轉(zhuǎn)化成乙醇，產(chǎn)量更高，能耗更低，單位體積乙醇的投資成本更低，而且玉米油回收率提高50%[28]。根據(jù)國際《可再生能源2019》發(fā)展報告，中國將是生物質(zhì)能生產(chǎn)最大的國家。在中國很多省份開展的10%乙醇混合燃料的使用以及不斷增長的投資使得乙醇生產(chǎn)將實現(xiàn)3倍增長。美國燃料乙醇產(chǎn)量約占全球的43%，巴西約占32%，中國約占3%。利用玉米生產(chǎn)乙醇的成本為0.25 USD/L，利用甘蔗生產(chǎn)乙醇的成本為0.2 USD/L，利用纖維素生產(chǎn)乙醇的成本達到1.4 USD/L。美國和丹麥合作開發(fā)的以纖維素酶為主的REnescience技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用纖維素酶等酶液化溶解城市垃圾，不但將廢物轉(zhuǎn)化為能源，同時不需要燃燒廢物，將其處理成生物液體(用于生產(chǎn)沼氣)和固體，使得長期以來難以處理的城市垃圾能夠回收利用[32-33]。此外，纖維素酶還能提高產(chǎn)生物質(zhì)氣的產(chǎn)率，明顯降低城市污水中的COD值。

2.2.2食品工業(yè)領(lǐng)域

在食品工業(yè)中纖維素酶應(yīng)用范圍較為廣泛，在發(fā)酵面點類食品使用可以提高面包等制品的烘培品質(zhì)和營養(yǎng)；在醬油釀造加入添加，可以加快發(fā)酵速度，改善醬油風(fēng)味和質(zhì)量；在茶葉加工中加入纖維素酶，可加快釋放茶多糖，提高茶多酚的萃取率，具有較好的穩(wěn)定性；在生產(chǎn)水果蔬菜罐頭過程中加入纖維素酶，可控制保持果汁的顏色不被降解，提高加工果蔬汁的出汁率，并且改善果汁色澤和貯藏的穩(wěn)定性。纖維素酶在加入煙草和人參生產(chǎn)中也發(fā)揮一定作用，可提高煙草品質(zhì)和人參有效成分的提取率[34]。TANAKA[35]報道了從海洋中的野生黑魚腸道中分離出新的纖維素降解細菌，經(jīng)鑒定為微泡菌屬GL-2，所產(chǎn)纖維素酶的水解產(chǎn)物是纖維二糖，可作為食品工業(yè)生產(chǎn)纖維二糖的潛在來源。LMJ C D等[36]利用芽孢桿菌分泌的嗜熱纖維素酶來改善菠蘿汁的提取澄清工藝。

2.2.3飼料工業(yè)領(lǐng)域

酸性纖維素酶在飼料加工行業(yè)中利用較為廣泛，是目前研究的重點[37]。因畜禽飼料中含有大量的纖維素，纖維素酶作為飼料添加劑(添加量為0.1%～0.3%)，添加到飼料中可促進牲畜食欲,還可以增加和補充動物體內(nèi)各種消化酶的含量，預(yù)防和治療一些家畜常見胃腸道疾病[38,39]。在大麥和玉米中添加纖維素酶，可明顯增加糖的總含量。在青貯飼料中加纖維素酶制劑，纖維素分解乳酸發(fā)酵，使得青貯飼料更佳柔軟，口感更好，同時減低飼料的酸度[40]。在酒糟中添加纖維素降解菌不僅可以豐富飼料的來源，還能提高飼料的品質(zhì)、改善酒糟在動物體內(nèi)消化率低的問題，同時還能豐富動物體內(nèi)的同源酶類，降低抗?fàn)I養(yǎng)因子[41]。聶利波等[42]研究了枯草芽孢桿菌Kpg所產(chǎn)的纖維素酶，將其加入雞飼料中，能夠顯著降低麩皮中的纖維素含量，明顯提高雞對粗纖維的消化率。

2.2.4紡織工業(yè)領(lǐng)域

纖維素酶被應(yīng)用于紡織工業(yè)中用來減少布料的變色和起毛現(xiàn)象。紡織工業(yè)的退漿過程是從織物上除去淀粉，將纖維素酶隨同上漿劑添加到紗線中，起到增強劑的作用，以防止織造過程中經(jīng)紗斷裂。纖維素酶用于降解亞麻纖維等極其細小的纖維，同時不破壞纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[43]。纖維素酶還可以用來制造牛仔褲的石洗外觀。通常，嗜熱纖維素酶用于代替石磨水洗牛仔褲，應(yīng)用在靛藍牛仔服裝中，以獲得相同染料脫色等效果。大多數(shù)棉混紡服裝在反復(fù)洗滌過程中，由于表面存在部分分離的微纖維，往往會變得蓬松和無光澤。利用酸性纖維素酶催化降解纖維素等大分子，使織物變得光潔、手感柔軟、并可防止起球，提高產(chǎn)品檔次[44]。

2.2.5洗滌劑工業(yè)領(lǐng)域

隨著我國對洗滌行業(yè)綠色化發(fā)展的要求，將生物酶技術(shù)應(yīng)用于洗滌劑如洗衣凝珠生產(chǎn)中，纖維素酶通過穿越紡織物的纖維間空間而起作用，以改善織物的光滑度和去污能力，同時保持衣物的色澤和亮度[45]。洗滌制劑中通常使用堿性纖維素酶, 即減少了對人體有毒成分的洗滌劑的用量，同時也利于降低能源消耗和保護環(huán)境。楊媛等[46]采用羧甲基纖維素法檢測洗衣凝珠中的纖維素酶，結(jié)果表明在市售洗衣凝珠中添加0.5%纖維素酶，由顯微鏡下觀察國標(biāo)污布JB-01去污漬能力效果更佳。

2.2.6造紙工業(yè)領(lǐng)域

在木質(zhì)材料的機械制漿過程中，用纖維素酶制備的紙漿具有多種應(yīng)用，包括節(jié)能，提高機械強度等。此外，纖維素酶還可以增強紙漿的可漂白性和不同類型紙廢料的脫墨，減少了紙漿細顆粒，改進了紙的光纖維度[47]。將纖維素酶與木聚糖酶組合使用，可以用于制備可生物降解的紙板和制造紙巾、衛(wèi)生紙等。

3 纖維素降解菌的未來趨勢

現(xiàn)如今地球上的石油、礦產(chǎn)等非可再生資源即將耗竭的時代，我國相繼推出有關(guān)開發(fā)新能源生物燃料的政策，以推動能源結(jié)構(gòu)調(diào)整，自然界中大量的秸稈廢料等天然纖維素作為潛在的生物能源可用于開發(fā)生產(chǎn)工業(yè)乙醇、燃料電池、動物飼料、洗滌用品等產(chǎn)品，具有極大的市場空間。生物降解纖維素具有環(huán)保、高效、經(jīng)濟等特點，高效利用纖維類物質(zhì)則需要根據(jù)特定的要求來選取纖維素降解菌。首先，纖維素降解菌菌株的選育工作仍需加強，通過宏基因組學(xué)、原生質(zhì)體融合、代謝組學(xué)等技術(shù)來獲得超高酶活工程菌[48]。其次，纖維素降解酶的性能仍需挖掘和改進。通過蛋白質(zhì)組學(xué)對纖維素降解菌進行工程設(shè)計，以增強纖維素酶水解效率和工業(yè)用酶產(chǎn)品的成本降低。最后，發(fā)酵工藝的建立、優(yōu)化和放大是實現(xiàn)高效生產(chǎn)關(guān)鍵性的最后一公里[49]。通過開發(fā)重組生物和基因表達系統(tǒng)，建立高效的流加補料發(fā)酵等工藝，最大限度地挖掘高產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶能力，以更好地生產(chǎn)纖維素酶以及生物燃料，用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。以上幾個方面的工作一旦取得突破性進展，必將使巨大的纖維素資源得以充分利用，纖維素生物化學(xué)品產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[50]。