化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌檢測能力驗(yàn)證分析

孫廷麗, 李彩玲，劉靜霞，王青柏，周少璐，謝小保

廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510070

化妝品因其含水量高、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，特別容易發(fā)生微生物的污染?；瘖y品中微生物的污染，不僅會引起產(chǎn)品的質(zhì)量下降，造成經(jīng)濟(jì)上的損失，也可能會對消費(fèi)者的健康造成威脅。因此，微生物的質(zhì)量控制和檢測是保障化妝品衛(wèi)生安全的重要環(huán)節(jié)[1]。耐熱大腸菌群主要來自人和溫血動物糞便，國內(nèi)外許多標(biāo)準(zhǔn)都會選用此類菌作糞便污染指標(biāo)來評價化妝品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷化妝品中是否有污染腸道致病菌的可能性[2]，金黃色葡萄球菌則是能引起人體局部化膿性疾病、敗血癥等的一種條件致病菌，也是化妝品污染中常見的一類微生物[3]。因此，這兩類菌也作為不得檢出的致病菌，被列為《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)化妝品的微生物常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目[4]。對上述兩類菌的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，是實(shí)驗(yàn)室檢測能力的重要組成部分。能力驗(yàn)證作為一種外部質(zhì)量控制的手段，是考察實(shí)驗(yàn)室檢測能力的有力手段，可以有效的檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的測試水平[5]。為提高實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制水平和考察實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)?zāi)芰?，?shí)驗(yàn)室參加了由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院組織的能力驗(yàn)證，并對能力驗(yàn)證實(shí)施過程和結(jié)果進(jìn)行了跟蹤分析，對實(shí)驗(yàn)室如何提高檢測準(zhǔn)確性和有效實(shí)施耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌內(nèi)部質(zhì)量控制提出了建議。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1試驗(yàn)樣品

采用ACAS-PT743能力驗(yàn)證樣品。樣品為白色凍干塊狀，為人工污染的化妝品樣品，包裝于真空西林瓶中，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供。樣品批號為ACAS-PT743(2019)，其中瓶號分別為19-M195、19-N405的樣品用于耐熱大腸菌群的檢測，瓶號19-C154,19-D117用于檢測金黃色葡萄球菌。

1.1.2培養(yǎng)基及儀器

標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌(E.coli)ATCC25922及金黃色葡萄球菌(S.aureus)ATCC 6538來源于美國模式菌種保藏中心(American Type Culture Collection)；雙料乳糖膽鹽培養(yǎng)基、蛋白胨、伊紅美蘭培養(yǎng)基(EMB)、SCDLP培養(yǎng)基、Baird-Parker培養(yǎng)基、血平板、甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基、靛基質(zhì)試驗(yàn)生化管、革蘭氏染色液、血漿凝固酶等微生物培養(yǎng)及鑒別培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；氯化鈉，分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；DNA提取試劑盒，MEGA；2X Taq PCR mix，北京全式金生物；HFsafe-1500生物安全柜(100級)，北京哈爾東聯(lián)儀器制造有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，生化培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌器，購自廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增儀，美國ABI公司。

1.2 試驗(yàn)方法

按照ACAS-PT742(2019)《化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌檢測能力驗(yàn)證》作業(yè)指導(dǎo)書和《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)[4]進(jìn)行耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌的分析和鑒定。同時，采用 16S rDNA基因測序的方法對可疑菌株進(jìn)行鑒定，最終綜合以上試驗(yàn)結(jié)果出具報告。試驗(yàn)中，分別將大腸桿菌ATCC25922及金黃色葡萄球菌ATCC 6538制成約102CFU/mL的菌懸液，作為對照菌株進(jìn)行陽性對照實(shí)驗(yàn)。

1.2.1樣品前處理

無菌條件下開啟樣品西林瓶，立即加入21 mL滅菌生理鹽水，充分溶解混勻，制成待檢樣品原液。取10 mL原液加入90 mL無菌生理鹽水中，混勻，制成1∶10檢液。上述過程注意保持無菌并充分混勻。

1.2.2耐熱大腸菌群的檢驗(yàn)

分別取10 mL 1∶10 檢液和10 mL大腸桿菌菌懸液加到10 mL雙料乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置(44.5±0.5)℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則取一環(huán)培養(yǎng)物，劃線EMB培養(yǎng)基，并繼續(xù)于36 ℃培養(yǎng)24 h，同時接種1～2滴培養(yǎng)物到蛋白胨水中，置44.5 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。EMB培養(yǎng)基上觀察是否存在典型菌落形態(tài)的菌株，如有可疑菌株，則實(shí)施革蘭氏染色進(jìn)行鏡檢；使用24 h蛋白胨水培養(yǎng)物進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn)。對可疑的菌落進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，結(jié)合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定的生化指標(biāo)特征綜合報告結(jié)果。

1.2.3金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)

分別取10 mL 1∶10檢液和10 mL金黃色葡萄球菌菌懸液加到90 mL SCDLP培養(yǎng)基中，充分混勻，置(36±1)℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。則取一環(huán)培養(yǎng)物，劃線BP平板，并繼續(xù)于(36±1)℃培養(yǎng)24 h，取典型單菌落再次接種于血平板上，于(36±1)℃培養(yǎng)24 h，挑取可疑單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，甘露醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)。對可疑的菌落進(jìn)行16S rDNA序列鑒定，結(jié)合《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定的生化指標(biāo)特征綜合報告結(jié)果。

1.2.416SrDNA序列鑒定方法

使用DNA快速提取試劑盒提取菌落DNA，并使用16S rDNA通用引物(5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’、5’-AAG GAG GTG ATG CAG CCG CA-3’)對提取的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增(體系為2 μL 模板，上下游引物各1 μL，2X Taq PCR Mix 25 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL；擴(kuò)增條件為95 ℃ 預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸90 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存?zhèn)溆?。對擴(kuò)增的序列進(jìn)行序列測定。測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。測序后，用Blast程序(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在Genbank中與已登錄的序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，以相似度最高的一種或幾種細(xì)菌作為鑒定候選菌種。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1耐熱大腸菌群

按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)第五章3耐熱大腸菌群的檢測方法對19-M195、19-N405進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表1。

表1 耐熱大腸菌群檢測結(jié)果

從表1結(jié)果可知，樣品19-M195與19-N405在進(jìn)行雙料乳糖膽鹽發(fā)酵時均出現(xiàn)了產(chǎn)酸產(chǎn)氣的現(xiàn)象，進(jìn)一步的生化實(shí)驗(yàn)中，劃線EMB平板后，19-M195的樣品平板上出現(xiàn)了兩種菌落，一種具備典型的耐熱大腸菌群的形態(tài)特征，另一種為紅色的圓形菌落，為非典型的耐熱大腸菌群生長特征。而19-N405的EMB培養(yǎng)則呈現(xiàn)典型的耐熱大腸菌群鑒別特征。對可疑菌落進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定，并對其進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，結(jié)果證實(shí)，在19-M195中分離出的兩種菌分別為大腸埃希氏菌(99%)及肺炎克雷伯氏菌(99%)，19-N405中分離到的菌種為大腸埃希氏菌(99%)。兩個樣品中均檢出了耐熱大腸菌群目標(biāo)菌。

2.1.2金黃色葡萄球菌

按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)第五章5金黃色葡萄球菌的檢測方法對19-C154,19-D117進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表2。

表2 金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果

從上表結(jié)果可知，能力驗(yàn)證中給出的兩個樣品，都含有微生物，其中19-C154上的菌落在血平板上不溶血，不具備金黃色葡萄球菌的典型特征，染色觀察為革蘭氏陽性，鏈球菌，基本可以排除檢出金黃色葡萄球菌的可能性。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，對其進(jìn)行了16S rDNA鑒定，結(jié)果證實(shí)為糞腸球菌(99%)，該樣品中未檢出金黃色葡萄球菌；樣品19-D117中的目標(biāo)菌在BP平板、血平板上呈現(xiàn)典型的金黃色葡萄球菌生長特征，革蘭氏染色成葡萄串狀陽性球菌，甘露醇發(fā)酵陽性，能在l2 h內(nèi)凝固血漿。上述生化特征表明，19-D117中含有目標(biāo)金黃色葡萄球菌，16S rDNA的鑒定結(jié)果也證明了這一結(jié)論。

2.1.3能力驗(yàn)證結(jié)果及反饋

測試結(jié)束后，上報本實(shí)驗(yàn)室測試結(jié)果，能力驗(yàn)證滿意。根據(jù)中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院的反饋結(jié)果，參加耐熱大腸菌群能力驗(yàn)證的共56家實(shí)驗(yàn)室，共發(fā)出82個陽性樣品和30個陰性樣品，結(jié)果不滿意的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為假陰性，滿意率98.2%；參加耐熱大腸菌群能力驗(yàn)證的共60家實(shí)驗(yàn)室，共發(fā)出82個陽性樣品和30個陰性樣品，結(jié)果不滿意的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果為假陰性，滿意率98.8%。

2.2 討論

綜合分析實(shí)驗(yàn)室本次及歷次參加能力驗(yàn)證的樣品情況、試驗(yàn)流程及檢測過程中的質(zhì)量控制情況，認(rèn)為存在以下對化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響因素：

1) 培養(yǎng)基是微生物檢驗(yàn)質(zhì)量控制的重要組成部分，培養(yǎng)基的質(zhì)量對最終結(jié)果的判斷影響極大。金黃色葡萄球菌檢測過程中使用的BP培養(yǎng)基及血漿凝固酶的質(zhì)量對最終結(jié)果的判定都有較大的影響。檢測過程中注意使用的培養(yǎng)基及試劑的質(zhì)量，做好試劑的技術(shù)驗(yàn)收工作及使用過程中的質(zhì)量控制工作，是實(shí)驗(yàn)室得到準(zhǔn)確試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)[6-8]。

2) 能力驗(yàn)證的樣品可能存在一定的均一性和穩(wěn)定性的差異，在收到樣品后，應(yīng)按照要求存儲并盡快檢測[9]，不當(dāng)?shù)拇鎯Νh(huán)境或樣品取樣不均一，都有可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽性或假陰性。同時，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意樣品前處理的過程，干粉西林瓶開瓶加水后需立即進(jìn)行取樣檢測，化妝品作為一種營養(yǎng)豐富的實(shí)驗(yàn)基質(zhì)，存放過長時間容易引入其它微生物污染，從而造成假陽性的結(jié)果。

3) 標(biāo)準(zhǔn)中對耐熱大腸菌群及金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)及鑒定過程中規(guī)定，培養(yǎng)時間為24 h～48 h，故培養(yǎng)過程中如特征不明顯的，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)足夠時間，以免菌落特征不典型，造成誤判。耐熱大腸菌群的檢測溫度要求為(44.5±0.5)℃，對溫度的要求比較高，如果實(shí)驗(yàn)室溫度控制偏差過大，則可能影響結(jié)果，此處最好使用隔水式恒溫培養(yǎng)箱。

4) 現(xiàn)實(shí)中受檢的化妝品樣品，可能同時存在多種微生物污染，即會存在干擾菌或者非典型特征菌落，特別是目標(biāo)菌株可能不是第一優(yōu)勢菌群的情況下，應(yīng)細(xì)心判斷，結(jié)合多種手段進(jìn)行確認(rèn)，不能主觀預(yù)判，以免出現(xiàn)錯誤。與此同時，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的鑒別指標(biāo)，也大多是針對特定類群的某一種典型菌種設(shè)置的，也可能導(dǎo)致其它非典型菌落被忽略。以耐熱大腸菌群為例，耐熱大腸菌群是指包含了大腸埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬在內(nèi)的一類腸道致病菌的統(tǒng)稱，而依據(jù)化妝品安全技術(shù)規(guī)范中規(guī)定的生化指標(biāo)，僅大腸埃希氏菌符合全部典型特征，其它多種耐熱大腸菌群的菌種則被排除[10]。故檢測中分離到的菌種，如菌種特征不顯著，應(yīng)特別注意結(jié)合多種手段進(jìn)行檢驗(yàn)，而不能僅僅根據(jù)形態(tài)特征或部分生化鑒定特征進(jìn)行判斷，以免出現(xiàn)假陰性。目前微生物檢測技術(shù)日新月異，許多的新的技術(shù)手段如 PCR[11]、等溫擴(kuò)增技術(shù)[12]、飛行質(zhì)譜分析[13]、熒光光電分析[14]及其它檢測技術(shù)手段[15,16]，都可以作為有效的輔助測試，排除假陰性或假陽性結(jié)果。

5) 實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量控制，注意使用陽性對照菌，方便直觀的判斷結(jié)果。為防止遺漏出現(xiàn)假陰性結(jié)果，應(yīng)多選幾個可疑菌落進(jìn)行鑒定，以更準(zhǔn)確的出具結(jié)果。

3 結(jié)論

根據(jù)能力驗(yàn)證的結(jié)果反饋情況，可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室具備并保持了檢出化妝品中耐熱大腸菌群和金黃色葡萄球菌的能力。在實(shí)施化妝品進(jìn)行耐熱大腸菌群及金黃色葡萄球菌的檢測時，比較容易發(fā)生假陰性的結(jié)果。

為預(yù)防假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量和檢驗(yàn)過程的控制。定期參加能力驗(yàn)證，并參照能力驗(yàn)證樣品制備實(shí)施實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的盲樣或考核樣品，有助于全方位的檢測實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力，提高實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平。