低溫等離子體技術滅活細菌芽孢的研究進展

成軍虎，張彥，韓忠

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（2.華南理工大學現(xiàn)代食品工程研究中心，廣東廣州 510006）

細菌芽孢的抗逆性強，在高低溫、強酸強堿、高壓、紫外線輻射等惡劣的環(huán)境下依然能夠存活，比營養(yǎng)細胞更能抵抗外界不良環(huán)境因子。食物中殘留的細菌芽孢萌發(fā)并大量繁殖之后，會造成食物腐敗變質，甚至引發(fā)疾病，給食品安全帶來很大的風險。

常見的引起食品腐敗變質和食源性疾病的芽孢桿菌有蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）等。蠟樣芽孢桿菌常殘留于飯類、肉類及奶類食物中，能夠產生嘔吐毒素和多種腸毒素，引發(fā)嘔吐和腹瀉，在常溫下儲存含有蠟樣芽孢桿菌的奶粉，一天之后能檢測出嘔吐毒素[1]。脂環(huán)酸芽孢桿菌極耐酸、耐熱，能在pH 2.0～6.0和25～60 ℃的溫度下生長繁殖[2]，常存在于水果和蔬菜表面，是引起果汁腐敗變質的主要菌種，特別是巴氏消毒后的果汁[3]。

一般而言，細菌芽孢的形成是由外界營養(yǎng)物質的不足引起的，其過程復雜，主要經(jīng)歷的幾個階段如圖1所示[4]。芽孢形成的第一個標志為不對稱隔膜的出現(xiàn)，在細胞中央或一端，細胞膜內陷形成隔膜，產生小細胞。其后，小細胞被多層膜包裹逐步形成芽孢，在這個過程中，礦物質元素和多種化合物被運輸進孢內，芽孢內的pH值維持在較低的水平以減少代謝活動，芽孢核內含水量處于30%～40%（營養(yǎng)細胞一般能達到70%～80%），此為芽孢的抗逆性提供了一定基礎[5]。芽孢的這一特殊結構具有強穩(wěn)定性，可以忍受極端環(huán)境，包括高溫、輻射、化學抗性等，因此通常難以滅活，給食品加工領域帶來挑戰(zhàn)。細菌芽孢的滅活已成為當前研究的熱點，而傳統(tǒng)的滅菌方法如濕熱殺菌、脈沖紫外線處理、輻射法等都存在不足之處，熱加工會引起食物質地、風味和營養(yǎng)的變化，脈沖紫外線處理在光的穿透性、光子和微生物接觸等方面有一定的限制性，而X、γ射線和電子束的殺菌方式則需要高成本的投入[6]。

低溫等離子體技術是近幾年發(fā)展起來的新型非熱殺菌技術。等離子體是指部分或全部電離的氣體，主要由自由電子、離子、紫外線（UV）光子以及由處于基態(tài)或激發(fā)態(tài)的原子組成的活性氧物質（Reactive oxygen species）、活性氮物質（Reactive nitrogen species），通常被稱為物質的第四態(tài)。在食品領域，已有研究表明，通過激發(fā)氣體放電產生等離子體，能夠抑制食品中的酶，對食品中存在的微生物進行滅活[7,8]，并且對微生物芽孢的滅活有著明顯的優(yōu)勢（表1）。目前，較為常見的氣體放電方式為介質阻擋放電和電暈放電。Huang[9]等在空氣介質阻擋放電6 min的條件下，實現(xiàn)了對淀粉芽孢桿菌芽孢的全部滅活。同時，低溫等離子體也可與其他技術聯(lián)合處理[10]，微波聯(lián)合氦氣等離子處理洋蔥粉末中蠟樣芽孢桿菌40 min，芽孢的數(shù)量減少2.10 log spores/cm2。

圖1 芽孢形成過程示意圖[4]Fig.1 The process of sporulation

由于低溫等離子體技術具有不需要提供高的壓強、消耗能量少、實驗操作較為簡單及設備支出費用相對較低，且在較溫和的條件下，能夠較大程度保持了食品的色澤、質構、營養(yǎng)成分，可以應用于水果、蔬菜、肉類、海鮮等食品的殺菌，在食品領域具有廣闊的發(fā)展前景。

表1 不同等離子體對芽孢的滅活處理Table 1 Different plasma treatments on the inactivation of bacterial spores

1 低溫等離子體技術

等離子體分為熱等離子體和非熱等離子體，非熱等離子體中又包括平衡（100～150 ℃）和非平衡（＜60 ℃）等離子體。在非平衡體系中冷卻離子和中性分子比通過轉移電子的能量更有效，且氣體能保持較低的溫度。因此，非平衡等離子體也稱為低溫離子體，一般通過放電激發(fā)氣體獲得。

在放電過程中，高密度的電子通過氣態(tài)介質在電場中被加速，使電子和氣體中的原子及分子發(fā)生初次大量碰撞，這些碰撞會改變電子的方向和能量，但是由于質量差異，一些質量較大的粒子在碰撞過程中幾乎沒有動量傳遞，使得它們能保持接近外界環(huán)境的溫度。當電子與原子或分子碰撞時，會發(fā)生一系列反應，反應的概率與電子的能量有關，包括[6]：

電離：e+M→M++2e，e+AB→A++B+2e

電子附著：e+M→M-，e+AB→A-+B

激發(fā)：e+M→M*+e

離解：e+AB→A+B

式中，M，A，B為原子；AB為分子。

對于在大氣壓下空氣等離子，氧氣和氮氣經(jīng)過電離、離解等反應生成基態(tài)或激發(fā)態(tài)的粒子如 O(3P)、O(1D)、N(4S)等，它們具有比單分子之間碰撞具有更低的活化能，與電子發(fā)生二次碰撞，進一步生成大量的活性氧、活性氮物質。同時，伴隨著電子躍遷，會產生大量的紫外線，在紫外線和這些活性成分的作用下，對芽孢進行滅活。

2 低溫等離子體對芽孢內外部結構的影響

芽孢具有極強的抗逆性，但其抵御外界極端條件的機制仍然沒有很明確的說法。近年來的實驗研究發(fā)現(xiàn)，可能的原因主要有以幾點[18-21]：一是芽孢具有多層膜保護，芽孢衣、皮層、芽孢壁多層膜結構緊密復雜。二是芽孢形成時原生質體脫水和礦化導致內部含水量較低，產生吡啶二羧酸鈣鹽，內部pH在6.30～6.40范圍內，可防止蛋白質解折疊，質子化和去質子化，從而穩(wěn)定芽孢結構。三是芽孢內含有耐熱小分子酶、酸溶蛋白等，耐熱小分子酶在高溫情況下仍具有一定活力抵御外界環(huán)境的影響，酸溶蛋白可以與雙鏈DNA結合，從而起到保護DNA的作用，但不能與RNA或單鏈DNA結合。

通過低溫等離子體處理，可以在一定程度上實現(xiàn)對芽孢外部膜結構、膜蛋白以及內部酶活性、DNA雙螺旋分子的改變，從而滅活芽孢（圖1）。目前已有文獻表明[22-25]，低溫等離子體對芽孢滅活的機理主要有：（1）等離子體中的活性氧、活性氮物質對芽孢衣蛋白和肽聚糖皮質層有刻蝕作用，增加膜的透過性；（2）激發(fā)氣體所產生的紫外線（200～400 nm）對芽孢衣蛋白具有光子氧化作用，對芽孢內DNA分子雙螺旋結構具有破壞作用；（3）活性氧、活性氮物質通過擴散進入芽孢內，對細胞質膜、細胞質中的蛋白以及DNA產生不可逆的改變。以上三種方式聯(lián)合作用于芽孢，最終使芽孢破裂，實現(xiàn)對芽孢的滅活。

圖2 低溫等離子體滅活芽孢的機制Fig.2 The mechanisms of cold plasma on inactivation of bacterial spores

在低溫等離子體處理下，對芽孢外部結構影響主要表現(xiàn)為芽孢形態(tài)的改變、等離子體中的活性氧、活性氮物質對芽孢外層膜的刻蝕作用以及膜組成成分的改變。使用四組氣體（Ar，Ar+N2，Ar+O2，N2+O2）處理枯草芽孢桿菌，通過掃描電鏡可以觀察到芽孢長度逐漸減小[26]。Huang[9]等在大氣壓下使用空氣介質阻擋放電對解淀粉芽孢桿菌進行1～5 min的處理，與對照組相比，電鏡照片中所有的芽孢外層結構均發(fā)生改變（圖3a），在干燥情況下處理3 min的芽孢外層膜都被等離子體產生的活性物質和紫外線光子蝕刻，并且可以觀察到在表層有滲出物（圖3d箭頭所指），在干燥情況下處理5 min后的芽孢刻蝕程度更高，并且在皮層出現(xiàn)可見孔洞（圖3e箭頭所指）。而1 min濕潤條件下處理，對芽孢外層膜的刻蝕程度比干燥情況下更嚴重（圖3f），這也印證了后文中環(huán)境濕度的增加能提高芽孢滅活效率的結論。同時，通過對比處理前后的芽孢進行傅里葉變換衰減全反射紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，芽孢膜中的蛋白質性質與空間結構均發(fā)生了顯著變化，低溫等離子體處理后出現(xiàn)主要的三個峰值在波數(shù)為1558 cm-1、1656 cm-1及1515 cm-1處，1558 cm-1的峰對應于酰胺I帶中碳氧雙鍵的延伸，1656 cm-1處的峰與酰胺 I帶中蛋白質α螺旋結構改變有關，1515 cm-1峰值處的酪氨酸帶向下移位，表明蛋白質有可能發(fā)生聚集[27,28]。同時，為探究芽孢膜蛋白對等離子體的敏感性，對四種芽孢桿菌突變體進行等離子體滅活處理，四種突變體的芽孢膜上分別缺失四種特定的蛋白，結果發(fā)現(xiàn)，四種芽孢的存活率依賴于缺失的特定蛋白[29]。且處理一定時間后芽孢能夠幾乎全部釋放出細胞質中的吡啶二羧酸鈣鹽，分析可能與芽孢膜中脂質物質的改變有關[30,31]。

圖3 低溫等離子體對芽孢膜的刻蝕作用(Huang 2019)Fig.3 Etching effects of cold plasma on the spore membrane(This figure is adapted by Huang 2019)

對芽孢內部結構影響主要表現(xiàn)為細胞質中吡啶二羧酸鈣鹽的含量降低、芽孢內酶活性改變以及對芽孢內DNA的損傷。研究表明，在等離子體技術處理下，細胞內吡啶二羧酸鈣鹽的量隨著芽孢暴露時間的增加而降低，大量吡啶二羧酸鈣鹽通過芽胞膜滲出，其中部分也可能已經(jīng)被等離子體中的活性物質降解[14]。由于芽孢的抗逆性與其細胞內存有大量的吡啶二羧酸鈣鹽相關，其含量的減少能夠大幅度提高滅活率[19,21]。對處理5 min的蠟樣芽孢桿菌進行拉曼光譜分析[16]，細胞質中吡啶二羧酸鈣鹽的含量減少了21%。此外，Roth等人發(fā)現(xiàn)缺乏能夠合成吡啶二羧酸鈣鹽基因的芽孢桿菌在等離子體的處理下更容易被滅活[8]?？莶菅挎邨U菌內過氧化氫酶活性在等離子體處理下也發(fā)生了較大改變，處理30 s后，過氧化氫酶的活性隨處理時間的增加呈線性減小，且在15 s后降到檢測線以下[32]。芽孢內DNA攜帶著與芽孢內新陳代謝相關的信息，一旦相關的DNA受損，芽孢就很有可能死亡。研究表明，低溫等離子體能造成芽孢內的DNA損傷，且主要與激發(fā)氣體產生的紫外線有關，特別是激發(fā)氮氣產生的活性氮物質時，常常伴隨著較高強度紫外線的激發(fā)，產生對芽孢有害的光產物如胸腺嘧啶加合物[33]。紫外線根據(jù)波長可分為UV-C區(qū)（220～280 nm）、UV-B區(qū)（280～315 nm）和UV-A區(qū)（320～400 nm），不同波長的紫外線的產生受到多種因素的影響如激發(fā)氣體類型以及等離子體發(fā)射源與處理樣品之間的距離等，對DNA的損傷和芽孢滅活的貢獻率也不盡相同，目前仍沒有統(tǒng)一的結論。Hertwig[34]使用三組氣體（Ar，Ar+0.14% O2，Ar+0.14% O2+0.20% N2）對枯草芽孢桿菌進行滅活，并對滅活過程中芽孢滅活率和DNA損傷進行動力學分析，發(fā)現(xiàn)不同氣體條件下DNA損傷的動力學模型不同。使用不同截止波長的濾光器（SiO2，BG24A，MgF2，WG305等）對枯草芽孢桿菌在低溫等離子下處理10 s[11]，提取芽孢內DNA進行PCR擴增。在用WG305濾光器（50%截止波長為280 nm）處理時，芽孢滅活效果最低，DNA呈現(xiàn)中等損傷。但也有研究表明，在發(fā)射源與樣品之間的距離超過1.5 mm時，大氣壓下激發(fā)的UV-C區(qū)的紫外線會被空氣所吸收，無法達到樣品表面，對于芽孢衣蛋白的氧化作用及DNA損傷并不明顯[35]，Wang[16]等處理的樣品與等離子體發(fā)射源距離6 mm時，沒有檢測到UV-C區(qū)紫外線的現(xiàn)象。同時Pina[36]等的實驗中，氮氣激發(fā)的低溫等離子體處理下，UV-A區(qū)紫外線所占據(jù)的比例更大，在337 nm，357 nm，380 nm波長處出現(xiàn)三個峰值。此外，芽孢衣含有與DNA修復有關的蛋白如α/β型酸可溶蛋白和DNA修復蛋白等，其與修復核酸切除機理相關，對突變體芽孢（缺乏α/β型酸可溶蛋白）進行低溫等離子體處理的實驗中發(fā)現(xiàn)，突變體對于在處理下的環(huán)境敏感性增加，在一定程度上間接表明低溫等離子體會損傷芽孢內DNA，使芽孢滅活率降低[35]。但目前對芽孢內外結構特別是 DNA損傷機制的研究仍較少，還需更多的實驗闡述其分子機理。

3 低溫等離子體對芽孢類微生物滅活條件

表2 影響低溫等離子體滅活芽孢的因素Table 2 Factors that affect the inactivation of bacterial spores by cold plasma

本部分主要闡述對芽孢類微生物的滅活中，在氣體組成、裝置功率、電壓、環(huán)境濕度、接觸樣品和處理方式等條件不同對芽孢滅活程度的影響（表2）。

3.1 不同氣體組成對芽孢類微生物滅活影響

被電離氣體的組成成分和比例直接影響到等離子體活性氧、氮物質以及紫外線的產生。目前，常用于電離的氣體有空氣、氮氣、氧氣、二氧化碳、稀有氣體等，其產生的活性氧物質如O2、O3、O（1D）等對芽孢衣、芽胞膜有蝕刻作用；活性氮物質如 N2、N+等能夠通過激發(fā)紫外線產生光子造成芽孢內DNA的損傷[42]。

在用干燥空氣，氮氣，氧氣和二氧化碳滅活萎縮芽孢桿菌實驗中，用光學發(fā)射光譜法研究四種激發(fā)氣體，發(fā)現(xiàn)氮氣等離子體具有最高的發(fā)射強度，且產生紫外線的強度都高于其他三種氣體，可以使芽孢減少5.10 log(cfu/mL)[14]。使用N2/O2混合的表面微波等離子體處理嗜熱脂肪芽孢桿菌[17]，當氣體混合比例為10% N2+90% O2時，氧原子密度達到最大，掃描電鏡圖下觀察到芽孢膜蝕刻程度最高。在100% N2條件下，等離子體所激發(fā)的紫外線強度達到最大，但紫外線強度隨著氧氣比例的增加而減少。而當混合氣體中氧氣所占比例在30%-80%之間時，氧原子的蝕刻作用協(xié)同氮原子產生的紫外線對芽孢進行殺滅，此時滅活效率最高。

使用四組氣體（Ar，Ar+N2，Ar+O2，N2+O2）處理枯草芽孢桿菌，通過掃描電鏡可以觀察到芽孢長度逐漸減小，且在N2+O2條件下，芽孢的長度減小得最快，速率可達到3.25 nm/s。處理240 s后，Ar，Ar+N2，Ar+O2三組氣體對芽孢的滅活速率幾乎相同，而N2+O2對芽孢的滅活速率是其他三組的兩倍[26]。但Reineke[37]等使用三組氣體（Ar，Ar+0.14% O2，Ar+0.14% O2+0.20% N2）對枯草芽孢桿菌進行滅活的實驗中，對整個過程進行了三個階段的檢測，發(fā)現(xiàn)不同階段氣體滅活效率不同，而純氬氣總體的滅活效果最強。雖然發(fā)射光譜顯示在 Ar+0.13% O2+0.20% N2條件下，激發(fā)的紫外線光子是純氬氣的四倍，但此時滅活效果次于純氬氣。通常來說，加氧的氦氣會與電子發(fā)生碰撞，從而有助于提供更高水平的與氧有關的自由基與芽孢發(fā)生反應，并破壞芽孢的外部結構。但是，氧氣的負電性可能使氦氣與氧氣的混合氣體易于吸收等離子體中產生的電子，從而降低了電子能量和密度，削弱了對芽孢滅活的效率[43]。Hertwig[34]等使用同樣三組氣體測得結果也為氬氣滅活芽孢效果最強。由此可見，芽孢滅活的程度與氣體組成分和比例有著很大關系，在使用低溫等離子體處理芽孢類微生物時，還需根據(jù)自身處理裝置的條件和處理對象選擇合適的氣體進行實驗。

3.2 裝置功率和電壓的不同對芽孢類微生物滅活影響

在一定條件下，隨著低溫等離子體發(fā)生裝置功率和電壓的升高，芽孢存活率越低[17,39-41,44]。這是因為激發(fā)氣體所產生的等離子體濃度特別是活性氮物質的濃度，與裝置的功率和電壓呈正相關[36]。在一定范圍內，所使用的功率或電壓越大，在單位時間內電子的密度和能量越強，隨之產生的等離子體濃度越高，對芽孢內外結構的改變將會更顯著，從而達到滅活的效果。

Yang[17]等人發(fā)現(xiàn)，在滅活處理中，隨著等離子體裝置功率的增加，芽孢長度減小得越顯著。使用微波等離子體激發(fā)純氮氣處理嗜熱脂肪芽孢桿菌，在功率為400 W、600 W和800 W時，800 W功率實現(xiàn)了芽孢數(shù)量減少的最大值6 log(cfu/mL)，且在6 min，800 W的處理下，芽孢長度從1.80 μm減小到1.30 μm。在不同電壓下（V=3.50、4.65、5.50、6.50 kV），使用大氣壓-氦氣氧氣混合等離子體處理枯草芽孢桿菌10 min，隨著電壓的升高，芽孢數(shù)量的減少量從 1.80 log(cfu/mL)增加到4 log(cfu/mL)[39]。在大氣壓下使用等離子體射流對黑胡椒中的枯草芽孢桿菌在30 kV下處理3 min和5 min，對枯草芽孢桿菌的滅活率都高于在相同時間內 15 kV的處理，可以達到 1.63 log(cfu/mL)[40]。此外，Kovalova[44]等研究表明，電壓的類型也會對滅活效果產生影響，在用電暈放電處理蠟樣芽孢桿菌時，脈沖電源比直流電源效果更好，但是由于需要考慮到能量的損耗，目前很難直接比較兩種電源處理下對芽孢滅活率的影響，在這方面還需要更多的研究。

3.3 環(huán)境濕度、接觸樣品和處理方式的不同對芽孢類微生物滅活影響

在電離潮濕空氣時，能產生更多的活性物質如氫氧自由基及NO、NOx等提高滅活效率，其中占主導因素的為氫氧自由基。對帶有萎縮芽孢桿菌樣品的密封包裝充入干燥空氣和相對濕度為3%、10%、30%、50%、70%的潮濕空氣，進行介質阻擋放電滅菌，在潮濕空氣下的滅菌效果明顯高于干燥空氣，相對濕度為3%可以使萎縮芽胞桿菌減少約5 log(cfu/mL)，相對濕度10%達到6 log(cfu/mL)，高于相對濕度10%可以使芽孢完全滅活[38]。

Los[13]等同樣使用介質阻擋放電對親水性和疏水性生物膜上的萎縮芽孢桿菌進行處理，發(fā)現(xiàn)親水性的生物膜芽孢減少率最大，達到4.40 log(cfu/mL)。使用不同的樣品接觸表面對細菌芽孢的滅活作用效果也不同，用射頻等離子體處理枯草芽孢桿菌，在玻璃皮氏培養(yǎng)皿中芽孢減少2.40～2.80 log(cfu/mL)，使用玻璃微珠減少3.90～4.60 log(cfu/mL)，而用胡椒子作為樣品載體芽孢滅活率最高[34]。若是直接處理含有芽孢類微生物的食品，則滅活效果與樣品的大小也有關。除了接觸表面的性質以外，接觸樣品的空間結構大小同樣會對滅活率產生影響。Kim[36]等對不同顆粒大小的紅辣椒上的蠟樣芽孢桿菌進行處理，顆粒小的樣品有較大的三維空間，能夠使激發(fā)的等離子體與辣椒顆粒接觸更充分，處理后芽孢存活率較低，更適合應用于對微生物滅活。

處理方式在一定程度上也影響著等離子體處理后芽孢的存活率。激發(fā)氣體產生的低溫等離子體直接接觸樣品處理通常比間接接觸效果好，使用三種不同氣體（Air、90% N2+10% O2）直接或間接通過介質阻擋放電處理萎縮芽孢桿菌，使用空氣間接處理薄膜包裹下的細菌芽孢樣品30 s和60 s后，滅活效果較低且相差不大。而直接處理60 s芽孢存活率顯著降低。同時，65% O2+30% CO2+5% N2直接接觸處理60 s后獲得最高滅活率，芽孢至少減少6 log(cfu/mL)[38]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，加入其他物質與樣品細菌協(xié)同處理能提高芽孢的滅活率。金屬氧化物二氧化鈦具有微生物滅活和分解化學物質的能力，將二氧化鈦與帶有芽孢的細菌混合，聯(lián)合射頻等離子體進行滅活處理，能產生更多的活性氧，滅活效果相比于射頻等離子體單獨處理D值減少40%[45]。通過光譜分析發(fā)現(xiàn)，主要是由于二氧化鈦內部氧缺陷能級能量較低，二氧化鈦顆粒更容易被活化，所以能產生更多的活性氧自由基，從而增大了對芽孢膜的破壞能力，提高了芽孢滅活率。

4 結束語

由于低溫等離子體技術能在低溫下實現(xiàn)對微生物的滅活，在食品領域的應用越來越普遍。在關于低溫等離子體滅活芽孢類微生物的研究上，已報道的等離子體對芽孢滅活的內在機制，仍存在爭議，尚未有清晰的結論，需要更多科研工作者的進一步研究證實，對于影響滅活效果的內外界因素的研究較為明確，但由于使用裝置和處理條件的不同，很難設立最適合滅活的條件和標準，對于比較不同裝置對芽孢類微生物滅活的差異還有待研究。另外，低溫等離子體協(xié)同其他技術如微波處理，能夠提高芽孢滅活率，或加入一些具有滅菌效果的物質如二氧化鈦，與芽孢一起在等離子體條件下處理也能顯著提高滅活率。此外，在現(xiàn)實情況中，芽孢的生長速率往往不同，不同發(fā)育階段的芽孢（嫩芽孢、老芽孢）對于低溫等離子體的處理可能也會有不同的效果，目前仍未有相關的研究情況，未來在針對低溫等離子體處理不同發(fā)育階段下細菌芽孢的研究將會有廣闊的發(fā)展空間。