食品中沙門氏菌FTA膜結(jié)合跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法的建立

莊夢晴，張先舟，盧鑫，郭威，馬曉燕，張偉,,3

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071001）（2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北滄州 061100）（3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001）

沙門氏菌是一種人畜共患的致病菌。由沙門氏菌引起的食品中毒大多是由于其穿透胃腸粘膜致使細(xì)胞死亡造成的[1]，根據(jù)臨床表征可以分為胃腸炎型、類傷寒型、類霍亂型、類感冒型和敗血癥型[2]。在所有食源性致病菌引起的食物中毒事件中，沙門氏菌引起的食品安全事件居首位，具有高檢出率、高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[3]。數(shù)據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全球各個國家均存在不同程度的沙門氏菌污染問題[4,5]，由此引發(fā)的沙門氏菌相關(guān)疾病，對公眾安全產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

微生物的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測時間較長，對實(shí)驗(yàn)操作人員、周圍背景及設(shè)備的無菌環(huán)境都有很高的要求，并且無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測[7]。當(dāng)細(xì)菌處于活的不可培養(yǎng)（Viable but non culturable，VBNC）狀態(tài)時，會造成結(jié)果誤判[8]。免疫學(xué)方法特異性抗體的制備復(fù)雜[9]，當(dāng)出現(xiàn)抗原或抗體的相似結(jié)構(gòu)時，會影響檢測的特異性和重復(fù)性[10]，甚至造成最終結(jié)果的誤判[11]。隨著核酸體外擴(kuò)增技術(shù)的不斷發(fā)展，逐步建立了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）[12]、多重PCR（Multiplex PCR）[13]、實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）[14]等變溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，這些技術(shù)均需要復(fù)雜的熱循環(huán)系統(tǒng)，儀器昂貴，限制了其在基層現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用。為克服上述技術(shù)的缺點(diǎn)，研究人員創(chuàng)新性的發(fā)展了滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling circle amplification，RCA）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。但是，RCA技術(shù)需要鎖式探針、連接酶和探針環(huán)化過程，反應(yīng)時間較長（約4 h）[15]；LAMP技術(shù)存在引物設(shè)計(jì)復(fù)雜、需要多對引物[16]、產(chǎn)物間易相互作用造成非特異擴(kuò)增[17]、無法通過測序驗(yàn)證擴(kuò)增結(jié)果的正確性等問題。

近年來，本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）新方法，并逐漸在致病菌檢測領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)應(yīng)用[18-20]。該方法僅需一對引物，在恒溫條件下依靠BstDNA聚合酶即可實(shí)現(xiàn)線性DNA的擴(kuò)增。原理如圖1所示。正向引物（Forward primer，F(xiàn)WP）與模板DNA結(jié)合后，按照引物 5"→3"方向延伸，當(dāng)延伸至模板鏈的 5"端時，在BstDNA聚合酶作用下通過添加若干個核苷酸跨過線性DNA兩端的缺口，繼而將先前合成的互補(bǔ)鏈置換下來，繼續(xù)如“滾環(huán)”般循環(huán)往復(fù)的擴(kuò)增。先前合成的互補(bǔ)鏈不斷延伸，暴露出越來越多的反向引物（Reverse primer，RVP）結(jié)合位點(diǎn)，RVP與之結(jié)合并進(jìn)行延伸。周而復(fù)始，最終得到許多不同長度的串聯(lián)重復(fù)線性雙鏈DNA。

圖1 SRCA反應(yīng)原理圖Fig.1 The schematic diagram of SRCA assay

FTA膜（Flinders technology associates，F(xiàn)TA）是經(jīng)特殊的螯合劑和變性劑處理的棉纖維卡片，作為Whatman公司的一項(xiàng)專利技術(shù)創(chuàng)新性的應(yīng)用于室溫下核酸的采集、運(yùn)輸、純化和儲存[21]。當(dāng)細(xì)胞接觸FTA膜時，細(xì)胞膜裂解，核酸暴露同時被吸附固定在FTA膜上，經(jīng)特定純化試劑和緩沖溶液的洗滌干燥，即可直接作為模板。洗脫前后電鏡圖如圖2所示。該方法操作簡單，大大節(jié)省了檢測時間和檢測成本。FTA技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類DNA處理、法醫(yī)學(xué)、野生動植物DNA樣品、食源性致病菌、寄生蟲和病原體的檢測中[22,23]。

本研究利用FTA膜吸附固定核酸的方法快速提取模板DNA，根據(jù)沙門氏菌的invA基因設(shè)計(jì)及篩選引物，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入熒光染料進(jìn)行結(jié)果的判定。擴(kuò)增反應(yīng)在凹孔板中進(jìn)行，從而有望實(shí)現(xiàn)食品中沙門氏菌的大批量集約化快速檢測。

圖2 FTA膜洗脫前后電鏡圖Fig.2 Electron micrographs of FTA card before and after elution

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

本研究選取46株菌株作為研究對象，其中17株為沙門氏菌，29株為非沙門氏菌，進(jìn)行引物特異性的探究。研究所需菌種如表1所示。

表1 本研究所用菌種Table 1 Bacterias in this study

注：ATCC：美國模式菌種收集中心（America Type Culture Collection）；CMCC：中國醫(yī)學(xué)細(xì)胞保藏管理中心（China Medical Culture Collection）；CICC：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection）；LP：實(shí)驗(yàn)室保藏。

表2 沙門氏菌invA基因的引物Table 2 Primers of invA gene in Salmonella

1.1.2 材料與試劑

引物，華大基因公司；6×DNA Loading Buffer、dNTPs Mixture，北京博邁德公司；SYBR Green I（10,000×）、TE緩沖液（pH 8.0），北京索萊寶公司；2×TaqPCR Master Mix，北京全式金生物技術(shù)公司；BstDNA聚合酶、DNA Marker DL2000，大連寶生物公司；FTA膜、FTA純化試劑，Whatman公司。

檢測的食品樣品包括肉類38份，蛋類8份，奶類14份，共計(jì)60份。

1.1.3 儀器與設(shè)備

2720 Thermal cycler核酸擴(kuò)增儀，美國 Applied biosystems公司；DYY-8C電泳儀，北京六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像分析系統(tǒng)，北京乾明基因技術(shù)有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水槽，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)

挑取鼠傷寒沙門氏菌（CMCC 50115）菌株傳代培養(yǎng)3次。挑取典型單菌落接種到營養(yǎng)肉湯中，37 ℃過夜培養(yǎng)，使菌體富集，用以提取基因組DNA。

1.2.2 基因組DNA的提取

通過試劑盒法以及 FTA膜法進(jìn)行沙門氏菌基因組 DNA的提取。試劑盒法按照操作說明進(jìn)行提取DNA。FTA膜法：取40 μL過夜培養(yǎng)的菌液滴加至2.00 mm的FTA膜上，55 ℃～60 ℃干燥10 min，F(xiàn)TA純化試劑沖洗2次，TE緩沖液沖洗2次，55 ℃～60 ℃干燥10 min，將得到的吸附有沙門氏菌基因組DNA的FTA膜直接作為反應(yīng)的模板。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與篩選

本研究選擇沙門氏菌高度特異性和保守性的invA基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)[14,24]。通過使用 Primer 5.0和DNAMAN軟件設(shè)計(jì)沙門氏菌的特異性引物，引物序列如表2所示。

1.2.4 FTA-SRCA、SRCA和PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

FTA-SRCA的反應(yīng)體系為：2.00 μL正反向引物（0.50 μM），12.00 μL dNTPs（0.75 mM），3.00 μL l0×Thermopol Reaction Buffer（0.75×），6.00 μL Mg2+（3.00 mM），2.00 μLBstDNA聚合酶（大片段），無菌去離子水補(bǔ)足至40 μL。62 ℃反應(yīng)30 min，80 ℃滅酶5 min。向擴(kuò)增產(chǎn)物中滴加2.00 μL SYBR GreenI（50×）染料進(jìn)行顏色觀察，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)果的判定。

SRCA的反應(yīng)條件與FTA-SRCA反應(yīng)相同，在FTA-SRCA反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，增加了 3.00 μL模板DNA（3.10 ng/μL）。結(jié)果通過凝膠電泳法進(jìn)行觀察。

PCR反應(yīng)引物與SRCA方法相同。PCR的反應(yīng)體系為：11.00 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，1.00 μL 正反向引物（0.50 μM），1.00 μL 模板 DNA（3.10 ng/μL），無菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸1 min終止反應(yīng)。

1.2.5 FTA-SRCA擴(kuò)增反應(yīng)的測序分析

反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后，按照膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行純化，并按照基因克隆試劑盒操作說明進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，將菌液送至測序公司進(jìn)行測序。

1.2.6 引物特異性分析

利用FTA膜法提取表1中46株菌的基因組DNA作為模板，分別進(jìn)行SRCA反應(yīng)。通過向反應(yīng)產(chǎn)物中添加熒光染料的方法，進(jìn)行引物特異性分析。

1.2.7 靈敏度分析

將沙門氏菌菌液十倍梯度稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，測得菌液濃度為 6.81×107～6.81×10-1CFU/mL。利用試劑盒法提取不同濃度菌液的模板DNA后，分別利用SRCA和PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；同時利用FTA膜法提取模板DNA后，進(jìn)行FTA-SRCA反應(yīng)，并比較分析三種方法的靈敏度。

1.2.8 人工污染的牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限分析

向已證實(shí)不含有沙門氏菌的牛奶樣品中加入不同濃度的沙門氏菌菌懸液，均質(zhì)液中菌液濃度為3.22×107～3.22×10-1CFU/mL。利用試劑盒法提取基因組DNA后，分別進(jìn)行SRCA和PCR反應(yīng)；同時利用FTA膜法提取模板DNA后[25]，進(jìn)行FTA-SRCA反應(yīng)，并比較分析三種方法的檢出限。

1.2.9 FTA-SRCA方法的實(shí)際應(yīng)用與評價

為了評估 FTA-SRCA方法在實(shí)際樣品檢測中的可行性以及準(zhǔn)確性，本研究對60份樣品，分別用PCR方法、SRCA方法、FTA-SRCA方法及國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.4-2016[26]進(jìn)行檢測，計(jì)算得到各個方法的敏感性、特異性和符合率[27]。

敏感性=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%

特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%

符合率=(真陽性+真陰性)/(真陽性+假陰性+真陰性+假陽性)×100%

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

本研究中PCR和SRCA反應(yīng)結(jié)果均通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析，F(xiàn)TA-SRCA反應(yīng)結(jié)果通過觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號顏色變化進(jìn)行分析。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 FTA-SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物的測序分析

圖3 沙門氏菌FTA-SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物測序分析Fig.3 Sequencing analysis of FTA-SRCA amplification products of Salmonella

將FTA-SRCA反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，驗(yàn)證其是否按照SRCA反應(yīng)原理進(jìn)行擴(kuò)增，測序結(jié)果如圖3所示。由圖3a可知，擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的梯形條帶。由圖3b可知，第一條擴(kuò)增片段長度為60 bp，第二條擴(kuò)增片段包括兩段60 bp長度的目的片段以及添加片段，添加片段為正向引物的上游片段，長度為20 bp，因此，第二條擴(kuò)增片段的總長度為140 bp。第三條擴(kuò)增片段包括三段60 bp長度的目的片段以及兩段添加片段，總長度為220 bp。以此類推，第四條擴(kuò)增片段總長度為300 bp。其中，出現(xiàn)的錯配基因可能由于擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生錯配造成的。理論結(jié)果與實(shí)際測得的結(jié)果相同，因此，F(xiàn)TA-SRCA方法的擴(kuò)增結(jié)果正確。

2.2 引物特異性分析

本研究共采用46株菌株對引物進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。17株沙門氏菌均成功擴(kuò)增，熒光由橙色變?yōu)辄S綠色；29株非沙門氏菌均沒有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，仍為橙色。因此，針對invA基因設(shè)計(jì)的引物特異性極強(qiáng)，適用于沙門氏菌的檢測。

圖4 沙門氏菌引物特異性分析Fig.4 The primer specificity analysis of Salmonella

2.3 靈敏度分析

對不同核酸提取方法以及擴(kuò)增方法進(jìn)行靈敏度比較分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5a可知，利用試劑盒法提取模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，當(dāng)菌液濃度降低至6.81×101CFU/mL時不再產(chǎn)生擴(kuò)增條帶。因此，PCR方法的靈敏度為6.81×102CFU/mL。由圖5b可知，利用試劑盒法提取模板進(jìn)行SRCA反應(yīng)，當(dāng)菌液濃度降低至 6.81×100CFU/mL時為陰性擴(kuò)增結(jié)果。因此，SRCA方法的靈敏度為6.81×101CFU/mL，比PCR方法高10倍。向FTA-SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR GreenⅠ熒光染料，由圖5c可知，當(dāng)FTA膜處理的菌液濃度為 6.81×107～6.81×100CFU/mL時，熒光顏色均由橙色變?yōu)辄S綠色，為陽性結(jié)果；當(dāng)濃度為6.81×10-1CFU/mL時，熒光顏色仍為橙色，為陰性結(jié)果。因此，F(xiàn)TA-SRCA方法的靈敏度為 6.81×100CFU/mL。FTA-SRCA方法的靈敏度比PCR方法高100倍，比SRCA方法高10倍?，F(xiàn)有研究中，F(xiàn)TA-PCR檢測單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的靈敏度為1.10×102CFU/mL[28]，F(xiàn)TA-LAMP檢測阪崎腸桿菌的靈敏度為1.00×103CFU/mL[29]。綜上所述，F(xiàn)TA-SRCA方法具有更高的靈敏度。

圖5 靈敏度分析Fig.5 The sensitivity analysis

2.4 人工污染的牛奶樣品中沙門氏菌的檢出限分析

圖6 檢出限分析Fig.6 The detection limit analysis

分別采用PCR、SRCA和FTA-SRCA方法檢測人工污染的牛奶樣品中的沙門氏菌，對檢出限進(jìn)行比較分析，結(jié)果如圖6所示。由圖6a可知，當(dāng)樣品中沙門氏菌濃度降低至3.22×102CFU/mL，不再產(chǎn)生擴(kuò)增條帶。因此，PCR方法的檢出限為3.22×103CFU/mL。由圖6b可知，當(dāng)樣品中沙門氏菌濃度降低至 3.22×100CFU/mL，為陰性擴(kuò)增結(jié)果。因此，SRCA方法的檢出限為3.22×101CFU/mL。向FTA-SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green Ⅰ熒光染料，由圖6c可知，當(dāng)樣品中沙門氏菌菌液濃度為 3.22×107～3.22×100CFU/mL時，熒光顏色均由橙色變?yōu)辄S綠色。當(dāng)濃度為 3.22×10-1CFU/mL時，熒光顏色仍為橙色，為陰性結(jié)果。FTA-SRCA方法的檢出限為3.22×100CFU/mL，比PCR方法低 1000倍，比SRCA方法低 10倍。已報道的FTA-PCR檢測沙門氏菌方法的檢出限為 1.00×101CFU/mL[25]，F(xiàn)TA-SRCA方法的檢出限比其低 1個數(shù)量級。原因可能是試劑盒法提取的模板DNA中含有蛋白質(zhì)、脂肪等抑制因子，對擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用，大大降低了PCR檢測牛奶中沙門氏菌的靈敏程度，故PCR方法的檢出限比靈敏度低一個數(shù)量級。而因SRCA反應(yīng)的靈敏度比PCR高，一定程度上抵消了部分抑制作用，故SRCA反應(yīng)的靈敏度和檢出限在同一數(shù)量級。FTA膜提取方法一定程度上降低了雜質(zhì)含量，從而減小了抑制作用[30]。

2.5 FTA-SRCA方法的實(shí)際應(yīng)用與評價

本研究分別用PCR方法、SRCA方法、FTA-SRCA方法及國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 4789.4-2016對60份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，與國標(biāo)相比，PCR、SRCA和FTA-SRCA方法均出現(xiàn)更多的陽性結(jié)果，原因在于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法靈敏度較低，且不能檢測出VBNC狀態(tài)的菌株，而這些狀態(tài)的菌體仍具有致病的潛在危害。對分子擴(kuò)增方法而言，食品中不同狀態(tài)的沙門氏菌均含有基因組DNA，但其含量有所差異。SRCA擴(kuò)增方法的靈敏度比PCR高，可以檢測的沙門氏菌的檢出限更低；對核酸提取方法而言，F(xiàn)TA膜法核酸提取的效果優(yōu)于試劑盒法，故檢測出的陽性結(jié)果更多。

表2 實(shí)際樣品檢測結(jié)果Table 2 The results of actual sample detection

3 結(jié)論

3.1 本研究建立了一種FTA膜結(jié)合跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（FTA-SRCA）檢測食品中沙門氏菌的方法。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，操作簡單，節(jié)省了時間和成本；與變溫?cái)U(kuò)增方法相比，無需復(fù)雜昂貴的變溫儀器，無需對操作人員較高的技術(shù)要求；與等溫?cái)U(kuò)增方法LAMP相比，引物設(shè)計(jì)簡單，擴(kuò)增結(jié)果可通過測序驗(yàn)證，利用熒光可視法進(jìn)行結(jié)果的判定，避免了繁瑣的電泳過程；與RCA方法相比，無需探針環(huán)化過程，節(jié)省時間和成本。與試劑盒提取DNA的SRCA方法相比，核酸提取步驟簡單，成本降低約1/2，時間減少約3/4，利用凹孔板可實(shí)現(xiàn)對大批量樣品的集約化快速檢測。

3.2 綜上所述，本研究建立的檢測食品中沙門氏菌的FTA-SRCA方法切實(shí)可行。該方法操作簡便快速、成本低廉、特異性好、靈敏度高、檢測限低。利用FTA膜提取的基因組DNA吸附固定在膜上，經(jīng)過FTA純化試劑和TE緩沖液的沖洗，在一定程度上可以消除蛋白質(zhì)、油脂等雜質(zhì)對擴(kuò)增反應(yīng)的抑制作用的影響。反應(yīng)在凹孔板中恒溫進(jìn)行，可實(shí)現(xiàn)大批量樣品的集約化檢測。上述優(yōu)勢為該技術(shù)在基層檢測機(jī)構(gòu)中的應(yīng)用和推廣奠定了基礎(chǔ)。

3.3 目前，本研究所建立的 FTA-SRCA方法僅適用于定性檢測，試驗(yàn)所用的FTA標(biāo)準(zhǔn)膜將DNA固定在其纖維基質(zhì)上，導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)定量分析?？刹捎肍TA洗脫膜洗脫DNA，實(shí)現(xiàn)FTA-SRCA方法的定量檢測。另外，該方法無法區(qū)分死活菌，后續(xù)研究可將 PMA方法與FTA-SRCA技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)死活菌的識別和定量。FTA-SRCA方法也可用于寄生蟲、動植物病毒、轉(zhuǎn)基因食品和過敏原等方面的檢測，以期擴(kuò)大本方法的應(yīng)用范圍并實(shí)現(xiàn)其應(yīng)用價值。