基于電噴霧質(zhì)譜法及化學(xué)計(jì)量法篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分

王亞蘋，李晶峰，張凱月，張楠茜，高穎，張輝，孫佳明

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117）（2.東北亞生物科技有限公司，吉林長春 130117）（3.長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117）

鹿茸（Cervi CornuPantotrichum）是我國傳統(tǒng)名藥之一，為鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cervus nipponTemminck）或馬鹿（Cervus elaphusLinnaeus）的雄鹿未骨化而帶茸毛的幼角。在我國有幾千年的應(yīng)用歷史，味甘、咸，性溫，歸腎、肝經(jīng)[1,2]。在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為中品，具有壯腎陽，益精血，強(qiáng)筋骨等功效[3]。鹿茸中含有氨基酸、蛋白質(zhì)、磷脂、膽固醇等豐富的營養(yǎng)成分[4]。用于腎陽不足、精血虛虧、陽痿早泄、宮寒不孕、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、四肢冷、潰瘍久不愈合等[5]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞為睪丸間質(zhì)內(nèi)部的內(nèi)分泌細(xì)胞，其功能主要是分泌睪酮，分泌的睪酮含量占睪酮總量的95%[6]。通過睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的能力和增殖能力可以表現(xiàn)出其改善雄激素的分泌量和調(diào)節(jié)生理機(jī)能的能力[7]，故鹿茸的壯腎陽、益精血功效與睪酮分泌的水平是有著密切的關(guān)聯(lián)。

電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是一種軟電離技術(shù)[8]，為天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)研究的重要手段[9]。直接進(jìn)樣電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法只需要很少的樣品量，并且不需要對(duì)被分析物進(jìn)行分離處理，節(jié)省了分析步驟，提高了檢測效率。如能將其與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法結(jié)合應(yīng)用，就可將被分析中藥等復(fù)雜體系中化學(xué)成分組成及結(jié)構(gòu)與其對(duì)應(yīng)活性相關(guān)聯(lián)，從而達(dá)到快速篩選活性成分的目的[10]。本研究利用電噴霧質(zhì)譜法對(duì)鹿茸鮮品和傳統(tǒng)加工品的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量法對(duì)所獲得的電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜及其促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[11]，快速篩選分析出鹿茸中具有促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的可能活性成分及其結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探尋鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 樣品與試劑

鹿茸樣品采購于吉林省東豐鹿場；乙腈、甲醇和甲酸（色譜純），美國Fisher公司；超純水，美國Milli-Q純水儀；四甲基偶氮唑鹽（MTT），美國Amresco公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司，其它試劑為分析純，北京化工廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

6320 ion-trap電噴霧離子阱質(zhì)譜，美國Agilent公司；KQ3200BE超聲波清洗器，中國昆山市超聲儀有限公司；Model680型酶標(biāo)儀，日本TAKARA公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)，中國上海安亭科學(xué)儀器有限公司；BP211D型十萬分之一電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；GZLY-0.4型藥用真空冷凍干燥機(jī)，北京速原中天科技有限公司；MiliQ超純水器，美國密理博公司；Millipore微濾儀，美國Millipore公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將新鮮二杠鹿茸用酒精燈火燎去毛，縱向切成 2份，其中1份用保鮮膜將其斷面包裹，用于傳統(tǒng)加工，1份作為鮮品。

傳統(tǒng)加工：先將包裹好的鹿茸放入沸水中進(jìn)行煮炸，每次1 min；煮炸5次，每次煮炸后將連有氮?dú)獾?6號(hào)針頭插入到包裹好的茸尖端進(jìn)行排血，最后一次煮炸排血后放入70 ℃的烘箱中烘烤8 h，取出切成小塊，水洗5次，將加工后的樣品裝袋并保存于4 ℃的恒溫冰箱中貯藏備用[12]。

取制備好的鹿茸鮮品以及加工品各 20 g，以 10倍量的水進(jìn)行組織粉碎，在4 ℃下浸提24 h。取出離心（3600 r/min，10 min），上清液進(jìn)行微濾，將微濾液凍干，備用。

稱取上述樣品凍干粉各1 mg，以70%甲醇溶解并定容至1 mL，12000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm的醇膜過濾，濾液用于電噴霧質(zhì)譜分析。

1.2.2 測定條件

質(zhì)量范圍m/z：200～500，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)經(jīng)過校正；目標(biāo)分子量：400；采用正離子模式。樣品由流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，流速：5 μL/min；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9 mL/min；霧化氣壓強(qiáng)：0.24 MPA（35.0 psi）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV。

1.2.3 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)

取SD雄性成年大鼠體重250～300 g，隨機(jī)分組。大鼠斷頸處死，剖開腹腔剝離取出睪丸，放入Type I膠原酶中，37 ℃恒溫振蕩器中振蕩消化30 min，用3倍體積 DMEM 稀釋終止消化。過濾、離心后制成懸浮液，吸出后接種于培養(yǎng)瓶中，放于37 ℃ CO2孵箱中培養(yǎng)[13]。

1.2.4 ELISA法測定睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮含量[14]

在96孔板中接種密度為105個(gè)/mL細(xì)胞懸液，100 μL/孔，培養(yǎng)2 d，吸去培養(yǎng)液。樣品組每組分別加入供試品溶液 50 μg/mL、100 μg/mL、200 (μg/mL)/孔；陽性組加入含人絨毛膜促性腺激素（HCG）的DMEM/F12培養(yǎng)液（含HCG終濃度為1 U/mL）100 μL；空白對(duì)照組加入DMEM/F12培養(yǎng)液100 μL；每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。處于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，向預(yù)先包被有大鼠睪酮單克隆抗體的酶標(biāo)板中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品。然后加入生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑，在37 ℃條件下反應(yīng)60 min形成免疫復(fù)合物。用洗滌液洗板5次后除去未結(jié)合的酶，再加入底物A、B，37 ℃條件下顯色10 min。加入終止液，在10 min內(nèi)測定450 nm下的吸光值[15]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）和偏最小二乘分析（PLS）；采用Excel進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸鮮品和加工品中化學(xué)成分的電噴霧質(zhì)譜分析

圖1 鹿茸鮮品電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜Fig.1 Electrospray mass spectrometry fingerprint of antler fresh products

圖2 鹿茸加工品電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜Fig.2 Electrospray mass spectrometry of pilose antler processed products

采用正離子掃描模式，在優(yōu)化的 ESI-MS/MS條件下對(duì)鹿茸鮮品和加工品進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到其一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖。

2.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮含量

表1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮含量（%）Table 1 Contents of testosterone secreted by testicular stromal cells (%)

實(shí)驗(yàn)室前期研究不同批次鹿茸鮮品和加工品中的氨基酸組成、含量以及睪酮分泌活性進(jìn)行測定，基于此發(fā)現(xiàn)了鹿茸加工前后特征性的差異氨基酸成分。但鹿茸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為多肽類成分，僅僅以氨基酸作為指標(biāo)性成分，無法有效的篩選鹿茸中促睪酮分泌的活性成分。因此在前期活性數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上結(jié)合基于ESI-MS/MS技術(shù)的鹿茸全成分的分析結(jié)果，更準(zhǔn)確有效的篩選活性成分[16]。

2.3 鹿茸鮮品和加工品電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的多元統(tǒng)計(jì)分析

將每個(gè)樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z200～500范圍內(nèi)的質(zhì)譜峰豐度作為變量，應(yīng)用SIMCA14.1軟件對(duì)每個(gè)導(dǎo)出的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，所得結(jié)果見圖3。圖中每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)樣本，鹿茸鮮品與加工品之間在一定程度上具有差異性。但PCA分析不能忽略組內(nèi)誤差，不能消除與研究目的無關(guān)的隨機(jī)誤差。因此采用有監(jiān)督的OPLS-DA可降低組內(nèi)差異，突出組間變異規(guī)律[17,18]。而OPLS-DA的使用必須以PLS-DA模型通過驗(yàn)證為基礎(chǔ)。

圖3 鹿茸鮮品與加工品的PCA得分散點(diǎn)圖Fig.3 PCA distribution of antler fresh and processed products

圖4 鹿茸鮮品與加工品的PLS-DA 模型驗(yàn)證圖Fig.4 PlS-DA model verification diagram of antler fresh products and processed products

圖5 鹿茸鮮品與加工品的OPLS-DA得分散點(diǎn)圖Fig.5 OPLS-DA scatter plot of fresh antler and processed products

圖4顯示PLS-DA模型的擬合程度良好，左端任何一次隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2（0.621）和Q2（-0.115）值均小于右端的原始值，表明原始模型的預(yù)測能力較任何一次隨機(jī)排列y變量的預(yù)測能力都大，即模型有效。

OPLS-DA分析能夠?qū)⒔M間差異最大化，由圖5可以看出鹿茸鮮品與加工品明顯分為兩類，得到良好區(qū)分，表明加工前后的鹿茸存在差異。同時(shí)采用VIP值的大小來篩選差異較大的成分，VIP值＞1的變量能夠?qū)悠返姆诸惼痍P(guān)鍵性作用。由表2分析可知m/z258、409、416、408、426、375、315、392、483、393、354、453和437可以作為鹿茸鮮品與加工品主要差異性成分。

表2 鹿茸鮮品與加工品的OPLS-DA VIP貢獻(xiàn)值（VIP＞1）Table 2 Opls-da VIP contribution value of velvet antler fresh products and processed products (VIP>1)

表3 各離子峰對(duì)促促睪酮分泌活性貢獻(xiàn)關(guān)聯(lián)度Table 3 Correlation degree of contribution of each ion peak to the activity of promoting testosterone secretion

2.4 鹿茸鮮品和加工品電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜與促睪酮分泌活性的灰色關(guān)聯(lián)度分析

灰色關(guān)聯(lián)分析的目的是確定參考序列和若干個(gè)比較序列之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度，尋求系統(tǒng)中各個(gè)因素間的主要關(guān)系[19]。通過對(duì)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化后，計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度。所得關(guān)聯(lián)度見表3，依據(jù)關(guān)聯(lián)性的大小，確定各成分對(duì)促睪酮分泌作用貢獻(xiàn)的大小順序?yàn)椋簃/z408＞416＞409＞426＞393＞359＞274＞258＞481＞315＞392＞497＞437＞483＞375＞453＞365＞376＞342＞475＞368＞350＞369＞363＞306＞382＞358＞354＞333。其中4個(gè)離子峰所代表的化學(xué)成分與促睪酮分泌活性的關(guān)聯(lián)度＞0.85，但與其它離子峰的關(guān)聯(lián)度差別不明顯，因此，鹿茸的促 Leydig細(xì)胞睪酮分泌作用是由多組分共同發(fā)揮作用的結(jié)果。

2.5 鹿茸鮮品和加工品電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜與促睪酮分泌活性的偏最小二乘法分析

偏最小二乘法(PLS)是一種高效的統(tǒng)計(jì)回歸技術(shù)，適用于基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析[20]。利用SIMCA14.1軟件，經(jīng)過多次提取主成分，多次迭代，擬合出鹿茸鮮品和加工品的電噴霧質(zhì)譜一級(jí)質(zhì)譜中共有離子峰豐度數(shù)據(jù)與促睪酮分泌活性數(shù)據(jù)之間的數(shù)理方程：Y=0.0600106X258+0.0781771X274-0.086587X306+0.113733X315-0.0797819X333+0.0968694X342-0.0432387X350+0.0388062X354-0.0576641X358+0.00138796X359-0.0175176X363-0.062117X365+0.041837 X368+0.052248X369-0.0666202X375+0.0339687X376+0.0597742X382-0.0131358X392+0.00365154X393+0.0131067X408+0.0275998X409+0.0854705X416+0.0868593X426+0.0721696X437+0.0808682X453+0.0650291X475+0.0585195X481+0.0607728X483+0.061128X497，各離子峰所代表的化學(xué)成分對(duì)對(duì)促睪酮分泌活性貢獻(xiàn)大小順序?yàn)椋簃/z315＞342＞426＞306＞416＞453＞333＞274＞437＞375＞475＞365＞497＞483＞258＞382＞481＞358＞369＞350＞369＞354＞376＞409＞363＞392＞408＞393＞359，其中m/z258、274、315、342、354、359、368、369、376、382、393、408、409、416、426、437、453、475、481、483和497與活性呈正相關(guān)，而m/z306、333、350、358、363、365、375和 392與活性呈負(fù)相關(guān)。

2.6 促睪酮分泌活性成分結(jié)構(gòu)分析

綜合灰色關(guān)聯(lián)度分析和偏最小二乘法分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)對(duì)促睪酮分泌活性貢獻(xiàn)最大的前5位離子峰有2個(gè)是重合的，分別是m/z416和426，同時(shí)與活性呈正相關(guān)，因此重點(diǎn)對(duì)這兩個(gè)離子峰所代表的化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2.6.1m/z416二級(jí)質(zhì)譜分析

圖6 m/z 416二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 Secondary mass spectrometry of m/z 416

二級(jí)質(zhì)譜圖中m/z416為[M+H]+離子峰，說明其分子量為415。在電子碰撞解離過程中，[M+H]+脫去一分子H2O產(chǎn)生m/z398，[M+H]+，酰胺鍵斷裂后電荷保留于N-端形成的b碎片離子，m/z值（b1：164，b2：251），在二級(jí)質(zhì)譜中從肽鏈C端被以此轟擊下來片段的m/z值為87（b2-b1），其對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基為Ser（105-H2O），b1碎片（m/z：164）對(duì)應(yīng)的氨基酸離子為 Tyr（181-NH3），[M+H]+（m/z：416)離子失去一分子Phe（165）生成b2離子（m/z：251）；所以，m/z為416的肽離子氨基酸序列應(yīng)為Tyr-Ser-Phe。

2.6.2m/z426二級(jí)質(zhì)譜分析

圖7 m/z 426二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.7 Secondary mass spectrometry of m/z 426

二級(jí)質(zhì)譜圖中m/z426為[M+H]+離子峰，說明其分子量為425。在電子碰撞解離過程中，[M+H]+脫去一分子H2O產(chǎn)生m/z408，酰胺鍵斷裂后電荷保留于N-端形成的 b 碎片離子m/z值（b1：148，b2：295），在二級(jí)質(zhì)譜中從肽鏈C端被以此轟擊下來片段的m/z值為 147（b2-b1），其對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基為 Phe（165-H2O），b1碎片（m/z：148）對(duì)應(yīng)的氨基酸離子為 Asn（165-NH3），[M+H]+（m/z：426）離子失去一分子Leu（131）生成b2離子（m/z：295），由于質(zhì)譜無法區(qū)分Leu和Ile，因此Leu也可能為Ile，故m/z為 426的肽離子氨基酸序列應(yīng)為 Phe-Phe-Ile或Phe-Phe-Leu。

3 討論

鹿茸作為我國傳統(tǒng)中藥保健食品，具有壯腎陽，益精血，增強(qiáng)免疫力，抗衰老等功效[21]。在鹿茸的眾多成分中，主要的活性成分為鹿茸多肽，鹿茸多肽具有促進(jìn)生殖功能、保護(hù)神經(jīng)、增強(qiáng)免疫力、保護(hù)心肌損傷、保護(hù)肝損傷、對(duì)組織創(chuàng)傷修復(fù)等功效[22]。楊若明等[23]通過觀察麋鹿茸對(duì)大鼠生殖系統(tǒng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麋鹿茸提取液具有明顯促進(jìn)雌鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育的作用。傅雷等[24]研究發(fā)現(xiàn)隨著鹿茸多肽含量的增加，鹿茸多肽可以促進(jìn)小鼠子宮的生長發(fā)育，且與劑量呈正相關(guān)。程津津等[25]通過不同分組小鼠灌胃發(fā)現(xiàn)不同劑量的鹿茸可使子宮和陰道器官的臟器指數(shù)以及雌二醇水平有所提高，說明鹿茸具有雌激素的作用。孫慧等[16]對(duì)鹿茸中的氨基酸組成進(jìn)行分析，確定谷氨酸可作為鹿茸加工品質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分之一。多肽類成分作為鹿茸的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本文針對(duì)此類物質(zhì)探索鹿茸對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的影響。

對(duì)鹿茸的研究分析方法多采用紫外分光光度法、紅外光譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法等[26]，而ESI-MS/MS作為一種軟電離技術(shù)，進(jìn)樣量少，且無需分離處理樣品，簡單快速。本研究利用 ESI-MS/MS對(duì)鹿茸加工前后的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)所獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，能夠很好的區(qū)分開鹿茸鮮品和傳統(tǒng)加工品，并篩選出m/z258、409、416、408、426、375、315、392、483、393、354、453和437的肽類成分可以作為鹿茸鮮品與加工品主要差異性物質(zhì)，為鹿茸傳統(tǒng)加工品的鑒定提供了新的思路和方法。

4 結(jié)論

應(yīng)用偏最小二乘法（PLS）和灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）對(duì)所獲得的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，快速篩選出具有促大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的可能成分。值得注意的是，通過與鹿茸加工前后一級(jí)譜數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果篩選出的差異性成分相對(duì)照可以發(fā)現(xiàn)m/z416和m/z426均為排名靠前的差異性成分，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)2個(gè)可能活性成分進(jìn)行解析，其結(jié)構(gòu)分別為Tyr-Ser-Phe（m/z416）和Phe-Phe-Leu/Ile（m/z426）。本研究推測出的活性成分為具有對(duì)活性正向影響的化合物，且排序靠前，關(guān)于排序靠后以及負(fù)向影響的化合物的結(jié)構(gòu)及其活性還需進(jìn)一步深入的研究。