博來霉素致小鼠肺纖維化模型的建立及生物標志物的篩選

王國遼，張 潔，饒家榕，莫睿文，遠立國,2*

(1.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣州 510642; 2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點實驗室，廣州 510642)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一類破壞性、不可逆損傷的彌漫性肺間質疾病，病因極其復雜，機制不明，可致肺功能障礙和呼吸衰竭，尚無有效的治療方法，預后極差。嚴重呼吸綜合征冠狀病毒和新型冠狀病毒感染均可引起以肺纖維化為病理特征的肺損害[1-2]，在動物臨床上也出現(xiàn)了與人PF臨床癥狀相似的發(fā)病特征[3-4]，對獸醫(yī)工作者提出巨大挑戰(zhàn)。早期診斷和治療對改善PF的預后意義重大，研究發(fā)現(xiàn)，基質金屬蛋白酶7(MMP-7)、涎液化糖鏈抗原6 (KL-6)、肺表面活性蛋白A(SP-A)、肺表面活性蛋白D(SP-D)等PF潛在的標志物[5-6]，可能在疾病狀態(tài)下具有輔助診斷、反映疾病嚴重程度、動態(tài)監(jiān)測、預后評估、治療靶點等作用[7-12]，因此，以特異性的生物標志物作為PF的檢測指標極具臨床應用價值[13]。但目前的研究多為針對某個標志物的單獨研究，存在諸多不足，其成果較少能應用于臨床，聯(lián)合多種標志物的研究有望克服這些缺點，從而提高檢測的準確度[8]，然而，相關研究較少，可重復性低，仍需進行大樣本的研究和驗證。且眾多的研究局限于靜態(tài)研究，缺乏動態(tài)追蹤。活體動物成像技術能在無創(chuàng)條件下對活體動物進行連續(xù)的成像追蹤，操作簡便、成像直觀，可能在肺纖維化診斷和疾病動態(tài)追蹤中具有實用價值。

因此，本試驗建立了BLM誘導小鼠PF模型，擬評估MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D 4種標志物在PF小鼠的表達變化及其聯(lián)合檢測的意義，輔以小動物活體成像技術探討非侵入性的靶向性近紅外熒光MMP-7探針在肺纖維化模型中的應用，為動物PF的早期診斷、動態(tài)監(jiān)測、預后、臨床治療及新藥的開發(fā)提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

健康SPF級雄性C57BL/6小鼠6～8周齡，體質量18～20 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。博來霉素(海正輝瑞制藥有限公司)，ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，活性近紅外熒光探針(IRB-NHS)檢測試劑盒(上?？七h迪生物科技有限公司)，MMP-7多抗、KL-6單抗(Abcam公司)，GAPDH(Bioworld公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組、建模 40只雄性C57BL/6小鼠隨機分為BLM模型組和對照組(CTL組)，模型組氣管滴注100 μL低(2.0 mg·kg-1)、中(3.5 mg·kg-1)、高(5.0 mg·kg-1)劑量的鹽酸博來霉素注射液建立肺纖維化模型，依次記為L組、M組和H組，對照組同法注入等量生理鹽水。

1.2.2 肺組織病理學檢查 肺組織經(jīng)石蠟切片后進行HE和Masson染色，采集圖像分析。按Szapiel 和Hubner[14-15]的方法進行肺泡炎和纖維化程度評分。

1.2.3 血清及肺組織MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D的表達 1)ELISA檢測：按照試劑盒說明書進行MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D血清指標含量檢測，計算樣本濃度。2)RT-PCR檢測：取小鼠左肺提取RNA，建立RT-PCR體系，擴增并檢測目的基因表達，引物序列：MMP-7 F: -3′5′-TTGAACCTGGTACATTGGCTG-3′，R: 5′-GCATCTATCACAGCGTGTTCC-3′，KL-6 F: 5′-ATCGGGGTT-TTACCTGGAAG-3′，R: 5′-CACCACAGCTGGG-TTGGTAT-3′；SP-A F: 5′-CCAATGGGCAGTCAGTC-3′，R: 5′-CCTAAGTAGGGATAGGTG-TT-3′；SP-D F: 5′-CTCTCCTGAGCACGGGACTA-3′，R: 5′-AGCCATTCTCTCCTTTGGGT-3′；GAPDH F: 5′-TTCTGATCTCAGCTCCCCTG-3′，R: 5′-GGCAACAATCTCCACTTTGC-3′。求目的基因與對照基因的Ct平均值，利用公式(2-ΔΔct)計算結果。

1.2.4 MMP-7抗體近紅外熒光活體成像靶向性研究 小鼠腹腔注射MMP-7抗體標記的近紅外熒光探針后，于1.0、1.5、2.0、12.0、24.0、48.0 h應用小動物活體光學成像儀(激發(fā)波長為745 nm，曝光時間1 s，吸收光譜信號收集400～900 nm)采集圖像分析。

1.2.5 MMP-7、KL-6蛋白表達及分布 1)免疫組化檢測：肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，參照說明書進行操作，采集圖像分析。2)免疫蛋白印跡法：提取肺組織總蛋白并測定蛋白濃度，Western blot 檢測蛋白的表達。

2 結 果

2.1 小鼠生存率及體質量變化

造模時對照組和模型組各有1只小鼠死亡，氣管暴露法給藥存在一定風險。造模后，對照組的生存率為100.00%，模型組的生存率分別為94.44%、79.92%、35.96%。模型組小鼠體質量造模后持續(xù)下降，第10天降到最低點，與對照組差異顯著(P<0.05，圖1)。

A.體質量; B.生存率A. Body weight; B. Survival rate圖1 小鼠體質量及生存率Fig.1 The survival rate and body weight of mice

2.2 肺組織病理學檢查

2.2.1 眼觀病變 L組有白色條索狀不規(guī)則紋路；M組肺組織有點狀出血區(qū)域，部分肺葉有片狀梗死區(qū)域；H組出現(xiàn)大面積淤血，呈暗紅色，肺體積縮小，質地較硬(圖2)。

A.對照組；B.L組；C.M組；D.H組A. Group CTL；B. Group L；C. Group M；D. Group H圖2 BLM攝入28 d后肺組織眼觀病變Fig.2 Pathological changes after administration at day 28

2.2.2 肺泡炎評分 HE染色對照組未見異常；模型組隨劑量增高，出現(xiàn)不同程度的肺泡壁增厚、炎性細胞浸潤、肺泡結構紊亂或破壞、彌漫性出血、淡粉色膠原纖維沉積、間質性肺炎等肺實變(圖3)。BLM攝入劑量與肺泡炎程度評分相關性系數(shù)為0.992(P=0.008<0.01)，表明BLM攝入劑量與肺泡炎程度顯著相關。

A.CTL組；B.L組；C.M組；D.H組A. Group CTL；B. Group L；C. Group M；D. Group H圖3 肺組織HE染色結果(200×)Fig.3 HE staining results of lung tissue (200×)

2.2.3 肺纖維化評分 Masson染色對照組小鼠肺組織結構清晰，肺泡壁完整，極少量纖維藍染，主要分布于大支氣管周圍；模型組小鼠肺組織均有不同程度纖維化表現(xiàn)，可見膠原纖維沉積、有連續(xù)藍染區(qū)域、成纖維細胞異常增生，肺泡壁結構嚴重破壞，肺泡間隔增厚(圖4)。BLM攝入劑量與肺纖維化程度評分相關性系數(shù)為0.970(P=0.03<0.05)，表明BLM攝入劑量與肺纖維化程度顯著相關。

A.CTL組；B.L組；C.M組；D.H組A. Group CTL；B. Group L；C. Group M；D. Group H 圖4 肺組織Masson染色結果(200×)Fig.4 Masson staining results of lung tissue (200×)

2.3 血清中MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D含量

與對照組相比，模型組4種標志物的含量均升高，除L組和M組的SP-A外，其余各組均與對照組差異顯著(表1)。

2.4 肺組織中MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D mRNA含量

與對照組相比，模型組SP-A和SP-D mRNA表達降低，MMP-7和KL-6 mRNA表達升高(圖5)。

表1 血清MMP-7、KL-6/MUC1、SP-A及SP-D的表達結果

圖5 MMP-7、KL-6、SP-A及SP-D mRNA表達量變化Fig.5 The mRNA expressions of MMP-7, KL-6, SP-A, SP-D in lung tissue

2.5 活體成像下MMP-7抗體的分布

注射后2.0 h熒光信號分布于腹部的腎、肝、膀胱及呼吸道，12.0 h后，模型組熒光信號以呼吸道、肺部分布為主(圖6A)。48.0 h后，小鼠各器官熒光信號分析顯示，對照組小鼠內臟無熒光，H組熒光信號在肺部、呼吸道蓄積，其他模型組肺部未觀察到熒光信號(圖6B)。H組肺部熒光信號的輻射率分析發(fā)現(xiàn)MMP-7抗體持續(xù)表達且隨時間推移熒光信號逐漸增強(圖6C)。

2.6 肺組織MMP7、KL-6蛋白表達

2.6.1 免疫組化法 模型組MMP-7和KL-6主要表達在肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞和巨噬細胞，KL-6在H組成纖維細胞膠原纖維及細胞外基質高表達；定量分析MMP-7在對照組、L組、M組和H組的陽性表達率分別為(8.61±0.65)%、(15.48±0.44)%、(17.67±2.58)%和(20.53±4.61)%，KL-6分別為(7.88±0.88)%、(13.01±0.86)%、(26.33±5.96)%及(43.86±0.00)%，詳見圖7。

2.6.2 Western blot法 以GAPDH為內參蛋白，MMP-7、KL-6蛋白表達量隨著攝入劑量的增加而增加(圖8)，MMP-7、KL-6蛋白的異常表達增多與肺纖維化程度直接相關，提示可能是肺纖維化的生物標志物。

A. 不同時間點熒光信號體內分布情況; B：注射后48.0 h熒光信號在小鼠各臟器分布情況; C. 不同時間小鼠肺部熒光信號輻射率比較A. Fluorescence images in vivo at different time; B. Fluorescence images of in vitro organs after 48.0 h; C. Comparison of the of fluorescent signals圖6 近紅外熒光成像MMP-7抗體分布及代謝情況Fig.6 Distribution and metabolism of MMP-7 antibody near-infrared fluorescence in vivo imaging

A. MMP-7; B. KL-6; a. CTL組; b. L組; c. M組; d. H組; C、D. 定量分析結果A. MMP-7; B. KL-6; a. Group CTL; b. Group L; c. Group M; d. Group H; C、D. Results quantitative analysis圖7 肺組織免疫組化結果(IHC-P，400×)Fig.7 immunohistochemistry results of lung tissue(IHC-P，400×)

圖8 MMP-7、KL-6蛋白表達量的變化Fig.8 Changes of expressions of MMP-7, KL-6

3 討 論

肺纖維化是肺組織損傷后，上皮間充質轉化等一系列相關細胞因子相互作用，導致瘢痕組織替代正常肺組織的不易逆轉的病理過程，臨床上以特發(fā)性肺纖維化較為多見[16]。肺纖維化早期表現(xiàn)為中性粒細胞、淋巴細胞及炎性因子增多的肺泡炎，后期以巨噬細胞、成纖維細胞增多，細胞外基質沉積為主。本試驗通過氣管滴注2.0、3.5、5.0 mg·kg-13個不同劑量的BLM建模觀察肺纖維化的病變情況，綜合肺泡炎和肺纖維化程度評估發(fā)現(xiàn)肺纖維化的嚴重程度與給藥劑量直接相關，劑量越高，肺纖維化越明顯。L組纖維化程度最輕，M組肺纖維化特征典型且死亡率低，H組雖肺纖維化特征明顯但該劑量小鼠死亡率最高，因此，3.5 mg·kg-1是氣管滴注法建立模型較為理想的劑量。

生物標志物由于樣本易得、操作方便，具有疾病的早期診斷、病情動態(tài)監(jiān)測及預后評估等臨床作用而被廣泛研究[17]。MMP-7、KL-6、SP-A和SP-D已被報道為肺纖維化的潛在生物標志物[18-19]，具有很大的研究價值。本試驗聯(lián)合MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D 4種生物標志物進行研究，應用多種檢測手段進一步驗證它們與肺纖維化的相關性以及聯(lián)合檢測在肺纖維化診斷中的意義。試驗結果顯示，肺組織MMP-7和KL-6 的mRNA表達升高，SP-A與SP-D mRNA表達下降；血清中模型組4種生物標志物的表達水平均顯著高于對照組，與文獻報道一致[10, 20]，表明MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D的異常表達與肺纖維化密切相關。此外，不同檢測方法中，模型組各組不同肺纖維化程度小鼠4種標志物的表達水平與對照組相比，并不都具有顯著差異性，可見4種生物標志物的聯(lián)合檢測對提高肺纖維化不同程度和發(fā)展時期的診斷、動態(tài)監(jiān)測以及預后的準確率與敏感性至關重要。

SP-A和SP-D作為肺纖維化生物標志物已得到充分研究[17]，而越來越多證據(jù)表明，MMP-7和KL-6在肺纖維化的診斷、疾病活動監(jiān)測及預后上有重要價值[20-21]。試驗選擇mRNA表達量上升的MMP-7與KL-6，進一步驗證其蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白的陽性表達率隨著BLM攝入劑量的增高而升高，與前述試驗結果一致。免疫組化結果可見，MMP-7和 KL-6在肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞和巨噬細胞表達，且KL-6同時在成纖維細胞、細胞質內及細胞外基質高表達。

為研究標志物在活體動物肺纖維化過程中的動態(tài)變化，探索特異性的診斷方法，對MMP-7抗體進行標記，結果顯示，MMP-7探針經(jīng)過體循環(huán)和血液循環(huán)最終與肺組織上相關靶點特異性結合，其中，H組48 h后仍表達熒光信號，持續(xù)觀察到第6天熒光信號才完全消失，說明MMP-7具有肺組織特異性，能夠連續(xù)直觀地展示標志物在體內的動態(tài)分布，與體外檢測相結合，可提高診斷的準確性和便捷性，為肺纖維化的動態(tài)研究提供參考。

4 結 論

本試驗成功建立了BLM致小鼠肺纖維化模型，BLM攝入劑量越高肺纖維化程度越嚴重。MMP-7、KL-6、SP-A、SP-D在肺纖維化模型小鼠肺組織中的表達隨肺泡炎或纖維化的嚴重程度而增高或降低，表明它們是肺纖維化的標志物。4種生物標志物的聯(lián)合檢測可以提高結果的準確率和敏感性，對疾病的輔助診斷、動態(tài)監(jiān)測及預后具有較大的臨床應用價值，非侵入性的MMP-7探針可用于小鼠肺纖維化的動態(tài)監(jiān)測。