基因組學及其在白酒釀造基礎研究領域中的應用

余晶晶,黃永光

(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州大學貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025)

白酒是我國特有的傳統(tǒng)飲料酒種,釀造工藝復雜。根據其發(fā)酵原料、糖化發(fā)酵劑種類、生產工藝等不同,可分為醬香型、濃香型、清香型、清醬香型等十幾種香型。白酒的釀造屬于典型的多菌種固態(tài)發(fā)酵模式,發(fā)酵微生物是其釀造核心動力,微生物群落結構多樣性特征決定了白酒的風味與質量,對解析白酒風味成分及其發(fā)酵機理具有重要意義。然而傳統(tǒng)白酒自然發(fā)酵的開放式釀造致使其中的微生物結構極其復雜,使得解析微生物及其風味代謝機理成為了白酒釀造基礎研究領域中的重難點之一?；蚪M學技術以其通量高、規(guī)模大等特點為復雜多樣的微生物研究提供了新的技術手段[1],能夠對參與釀造的微生物基因組進行深度測序,成為架起釀造復雜微生物與風味成分之間的第一道橋梁。

近年,基因組學研究技術越來越多地被應用于食品微生物的研究中,針對白酒釀造中復雜的微生物,基因組學也為揭示其中的許多“未知因素”提供了有效方法。如鄧杰等[2]應用高通量測序技術解析濃香型白酒的微生物群落,結果表明該方法優(yōu)于其他分子生物學技術,能更加完整和準確地鑒別微生物群落、功能菌等；近2年，研究者們采用基因組學策略解析醬香型白酒制曲、制酒等發(fā)酵過程中參與的微生物菌群結構多樣性、微生態(tài)多樣性特征等,揭示了醬香白酒釀造過程中不為人知的菌群結構及資源,為解析傳統(tǒng)白酒釀造過程中微生物來源、生態(tài)結構等提供了科學依據[3-6]。上述研究表明,基因組學技術能夠從基因水平揭示白酒釀造微生物組成、結構、功能、代謝機制等信息,為傳統(tǒng)白酒的現代化釀造和轉型升級提供科技支撐。本文主要概述基因組學的關鍵技術及其在白酒釀造基礎研究領域中的應用,并介紹多組學方法在該領域的應用現狀。

1 基因組學關鍵技術概述

自1896年美國生物學家Walter Gilbert提出基因組研究的3個重要技術領域以來[7],基因組學技術日趨完善,包括基因組測序、測序數據處理、基因預測與注釋等,解析微生物序列、物種結構、功能組成等信息。在白酒釀造基礎研究領域中,基因組學技術同樣為研究傳統(tǒng)白酒釀造微生物提供了有效方法,是解析復雜風味物質及微生物代謝機制的前提。圖1總結了傳統(tǒng)研究技術與基因組學技術在解決微生物問題方面的差異。

1.1 基因組測序

基因組學的核心技術是基因組測序,高通量測序是目前最普及的測序技術,以其產出通量高,工作量小,信息量大等特點能夠實現快速測序,包括微生物全基因、宏基因組、16S rRNA等多種方法[8]。微生物全基因組測序的應用可實現對單個細胞或生物體遺傳物質信息總和的分析,如WU等[9]利用Illumina平臺解析某酒廠生產過程中地衣芽孢桿菌GMCC3963全基因組序列,結果表明該測序方法對序列區(qū)域覆蓋度高,覆蓋約200倍基因組的888 Mb成對末端數據。微生物宏基因組測序以微生物群體作為研究對象,通常用于解析白酒發(fā)酵酒醅、酒糟、窖泥等群體微生物。如GUO等[10]利用Illumina平臺對濃香型白酒發(fā)酵窖池中的微生物群落進行宏基因組測序,結果表明樣品中微生物群落結構存在顯著差異。16S rRNA與ITS測序是常用的擴增子測序方法,可用于鑒定樣本中的細菌或真菌,比較復雜環(huán)境中微生物的系統(tǒng)發(fā)育和分類,探索微生物群落組成信息。如羅方雯等[5]利用ITS及16S rDNA引物測序解析茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)域生產用大曲樣品真菌及細菌結構多樣性特征,并首次檢出醬香型白酒釀造環(huán)境中的特點酵母屬等微生物,豐富了白酒釀造微生物資源。

圖1 傳統(tǒng)研究技術與基因組學技術在解決微生物研究問題方面的差異Fig.1 The difference between traditional research and genomics techniques in solving the problem of microbial research

1.2 原始數據處理

DNA或RNA有上千個堿基長序列,而高通量測序技術存在堿基讀取短(200～300 bp)、可靠性低、易引入錯誤率等問題,為獲得完整的微生物基因組信息,測序時需將DNA或RNA分割成小片段,并于測序后利用軟件將其拼接成完整序列及質量控制。根據不同的數據類型,可采用相應的拼接及質控軟件,在傳統(tǒng)白酒釀造微生物基因研究中比較常用的是Fast Length Adjustment of Short Reads(FLASH)[11]軟件，將測序產生的paired-end reads快速拼接為DNA片段,并在此基礎上利用Trimmomatic[12]軟件對序列進行質量控制,以得到高質量且完整的微生物基因序列信息。

1.3 基因組注釋

通過分析處理獲得微生物序列信息是基因組學研究的難點之一。近年,已建立多種分析方法,包括基因組分裝(binning)、基因組樣本比較及分類、基因組結構及功能注釋等[13]。其中,核心技術是通過基因組注釋獲得微生物基因序列的結構和功能信息,主要分為2步：第1步是基因組結構注釋。預測基因組結構,搜索基因組中開放閱讀框(ORF)[13],以獲得微生物基因功能信息,常在NCBI(National Center for Biotechnology Information)平臺上采用Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)[14]比對定位已知基因并確定基因信息。第2步是基因功能注釋。包括基因功能注釋、非編碼RNA注釋等。該方法主要通過與各種功能數據庫,如SWISS-PROT(注釋性蛋白序列數據庫)[15]、GO(描述分子功能、生物過程和細胞成分的數據庫)[16]、COG(同源蛋白組群數據庫)[17]、KEGG(基因、蛋白質、化學物質組成的數據庫資源)[18]比對序列及捕獲基因的功能信息。

1.4 基因組網絡結構

基因組網絡指獲得微生物基因組信息并聚類后構建相鄰基因間的連接關系,以網絡圖的方式組織可視化基因組信息,研究基因組內的微生物系統(tǒng)發(fā)育關系,探討微生物的遺傳特征及多樣性等[19]。如,JIANG等[20]基于基因同源關系和位置信息創(chuàng)建了構建基因組網絡的方法,稱為基因組拓撲網絡(Genome Topology Network, GTN),用于研究密切相關的微生物基因組之間的結構變異,但該方法僅限于對完整基因組的研究;面對占絕大多數不完整的基因組,鄧嘯[19]對該方法進行了改進,以分析絕大部分不完整基因組。地衣芽孢桿菌作為白酒釀造過程中的高溫優(yōu)勢菌株,對其基因組拓撲網絡的研究同樣重要,如郭靜等[21]利用拓撲網絡結構研究地衣芽孢桿菌的蛋白質相互作用(PPI),結果表明PPI網絡在環(huán)境脅迫下的拓撲結構非常穩(wěn)定,在任何環(huán)境條件下都對維持細胞生存起到了至關重要的作用,該研究為解析白酒釀造過程中的重要微生物提供了方法參考。

2 基因組學策略解析釀造微生物群落結構及多樣性特征

2.1 解析釀造微生物群落結構

眾所周知,微生物對白酒的質量、風味起著決定性作用,然而白酒釀造微生物之間存在復雜的共生、拮抗、競爭[22]等種間關系,以整體協(xié)作的方式推動著白酒發(fā)酵的進行,因而有必要系統(tǒng)解析微生物的群落結構?；蚪M學技術具有快速解析的優(yōu)勢,被應用于解析白酒發(fā)酵微生物群落結構、優(yōu)勢菌種、未知菌種等信息。表1總結了基因組學在傳統(tǒng)白酒釀造微生物群落結構研究中的應用現狀。

表1 基因組學在傳統(tǒng)白酒釀造微生物群落結構研究中的應用現狀Table 1 Research status of genomic technology in Baijiu microbial community

獲得群落中微生物信息以后,則需利用生物信息學手段對所獲得的測序數據進行群落結構解析,分析思路如圖2所示。

圖2 微生物群落結構分析思路總結Fig.2 The ideas of microbial community structure analysis

2.2 解析釀造微生物多樣性特征

與以往解析多樣性方法相比,基因組學技術憑借其直接、快速、深入的特點,越來越多地被應用于解析白酒釀造微生物多樣性信息。常利用聚類反應產出樣本中物種數目,了解微生物多樣性變化趨勢,常見的豐度估計方法有α-多樣性和β-多樣性等。如王雪山等[27]為考察清香型白酒發(fā)酵過程中新、老酒廠的微生物種群演替差異,通過高通量測序及α-多樣性解析,表明不同環(huán)境酒醅中細菌多樣性隨時間變化規(guī)律差異較大;LI等[29]利用宏基因組測序考察經代謝芳香成分的酵母菌株強化的大曲對發(fā)酵微生物群落多樣性的影響,最終結果表明基于操作分類單元的所有稀疏曲線都趨于飽和,序列很好的表示了物種的多樣性。此外,考察發(fā)酵環(huán)境、原料和人工等因素對白酒釀造微生物多樣性的影響同樣很重要,如黎瑤依等[30]利用宏基因組學技術解析茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒各生產主釀區(qū)域的環(huán)境真菌菌群多樣性,結果表明釀造環(huán)境中標志性真菌隨釀造時空徑向變化而變化,且主要微生物的相對穩(wěn)定性是維持釀造微生態(tài)的關鍵?；蚪M學技術被證明可以高效的解析內在、外在因素對復雜微生物群落及多樣性的影響,為了解白酒工業(yè)化生產過程中的影響因素提供科學方法。

3 基因組學解析釀造微生物功能基因及其特征

解析白酒主體香成分一直以來是研究者關注的熱點,目前,濃香型、清香型白酒的主體香已明確,而醬香型白酒的主體香至今仍不清晰,對白酒風味成分的認識仍為欠缺,主要存在2大問題：一是對白酒釀造微生物的功能基因認識不清晰；二是對其代謝機制認識不清晰?；蚪M學被認為是對以上研究有利的,目前的研究主要集中在產風味和其他功能基因解析兩方面。

3.1 產風味物質的微生物功能基因解析

解析風味產物是白酒釀造研究中的突破點之一,以基因表達、特征風味化合物為導向解析微生物代謝物機理的策略為基因調控酶,酶參與調控代謝途徑及產物,以該思路可正向、逆向解析微生物功能基因。如LIU等[31]曾以該思路為導向解析紹興機械化黃酒發(fā)酵醪微生物,經Illumina平臺測序、基因預測及圖譜構建了一個風味代謝網絡,實現注釋基因ID、酶與微生物群的網絡連接,以此解析產生風味物質的功能基因,該方法的應用從“源頭”加深對白酒風味的認識。類似的研究還有LI等[32]從茅臺風味大曲中分離到嗜熱菌LaceyellasacchariFBKL 4.010菌株,利用全基因組解析及功能注釋發(fā)現其具有風味成分四甲基吡嗪形成的關鍵基因,為研究菌株的產香功能提供參考。上述研究表明,基因組學可應用于挖掘功能基因,深度解析白酒釀造過程中的功能貢獻微生物,實現對其根本性認識,為白酒工業(yè)化高質量生產的研究指明方向。

3.2 產其他特征物質的微生物功能基因解析

醬香型白酒的特殊釀造環(huán)境使微生物具有高滲、高溫等環(huán)境脅迫特征[33],基因組學技術則是深入認識微生物特殊功能的重要手段。如LU等[34]利用基因組技術從醬香型白酒釀造過程發(fā)現1株酵母具有強化代謝通路的基因組系統(tǒng),并結合轉錄組技術明確其共碳化功能的基因機理,該研究為提高菌株的育種策略提供了研究基礎。WANG等[35]從某窖泥菌株全基因組中解析到調控乙醇合成己酸的相關基因,而己酸可再轉化為白酒關鍵風味物質己酸乙酯,該研究為調控白酒生產過程中風味物質己酸乙酯的生物合成研究提供方向。

4 基因組學策略溯源釀造微生物及釀造產物

白酒釀造微生物多樣性特征明顯且來源較為復雜,然而目前對絕大多數釀造環(huán)境微生物及特殊產物來源的認識尚為缺乏。基因組學技術對微生物基因組的深度測序和功能解析,可溯源白酒釀造過程中有益、有害微生物及產物以期在白酒生產過程中達到“揚長避短”,調控優(yōu)質白酒工業(yè)化釀造的目的。

4.1 追溯釀造過程微生物來源

對于白酒開放式釀造過程中外界微生物是如何運動并參與到生產過程中的,人們知之甚少,也是為何1975年茅臺易地生產失敗的原因。BOKULICH等[36]曾利用分子生物學結合統(tǒng)計學方法跟蹤監(jiān)測食品發(fā)酵生產建筑周圍的有益、有害微生物,以實現對食品發(fā)酵過程中微生物遷移方向及影響因素的認識,該研究為追溯白酒釀造過程中復雜微生物來源提供了思路,而宏基因組學技術則是其中的關鍵手段之一。在白酒的釀造的研究中,WANG等[37]利用基因組學技術解析濃香型白酒生產過程中微生物來源,統(tǒng)計分析特征微生物及環(huán)境限定微生物,結果表明大曲是好氧菌和兼性好氧菌的主要來源,而發(fā)酵窖泥則是發(fā)酵厭氧菌的緩釋源。該方法追溯到了發(fā)酵過程中微生物群落的來源,為控制白酒釀造過程中復雜微生物提供了方向。

4.2 追溯釀造過程中產物來源

清晰認識白酒釀造微生物代謝產物及其來源是實現優(yōu)質白酒可控性生產的基礎,對產物的溯源有助于完善白酒發(fā)酵代謝物的系統(tǒng)性研究。盧建軍等[38]將基因組序列與功能數據庫比對,獲得白酒發(fā)酵代謝產物正丙醇的代謝途徑及參與其中的酶,故而通過酶搜索到關鍵微生物信息,以此溯源功能物質正丙醇。在另一項研究中,LI等[32]首先通過GC-MS解析到菌株FBKL 4.010產生最豐富的風味成分是四甲基吡嗪,再以物質、酶、基因為核心思想,逆向研究發(fā)現FBKL 4.010菌株中四甲基吡嗪代謝的關鍵基因并明確其代謝途徑,為其他未確認功能基因的識別提供了指導。

5 GWAS及多組學結合技術在白酒釀造中的應用現狀

基因組學技術可實現對白酒釀造微生物更深入的認識,以及后來興起的全基因組關聯研究(genome wide association study,GWAS)也為研究微生物遺傳性狀基因及其演變提供了手段,然而單方面的研究并不能完全揭示生物體的生命現象,因此需要應用多組學結合技術幫助我們解析白酒釀造微生物的整個生命過程。

5.1 全基因組關聯研究應用現狀

全基因組關聯研究是利用高通量基因分型技術在基因范圍內尋找單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNPs),起初是用于研究復雜疾病變異基因。隨著研究技術的不斷完善,越來越多地被應用于包括白酒釀造在內的多個領域中,發(fā)現影響性狀表達的基因,探索微生物演變情況,優(yōu)化菌種資源。如張偉平[39]為降低黃酒發(fā)酵過程中尿素的積累,利用全基因組關聯分析定位釀酒酵母的氮源代謝及尿素積累相關基因,結果表明該技術能夠從差異眾多的基因組中找到關鍵基因。JACKSON等[40]在菌株基因組的基礎上進行關聯分析,解析釀酒酵母的遺傳變異基因,對千余株釀酒酵母的SNPs進行主成分分析,探索其演化和起源情況,為研究菌株性狀的遺傳結構和遺傳缺失的來源提供了參考。

5.2 多組學方法在白酒釀造發(fā)酵基礎領域中的應用

GWAS僅針對基因層面,多組學結合技術則以核酸組、蛋白組、代謝組的結合實現從本質、表象、結果3方面揭示單一組學難以揭示的生命現象。近幾年,對白酒釀造微生物的研究主要集中在分別利用各組學研究微生物差異表達基因、發(fā)酵微生物間相互作用、解析代謝產物等。隨著科學研究的發(fā)展,多組學技術研究白酒釀造微生物越來越多的被應用,2015年,LU等[34]從白酒生產環(huán)境中分離到1株茅臺酒釀造用菌株MT1,結合基因組及轉錄組技術比較分析菌株的SNPs、插入和缺失基因等,發(fā)現其關鍵編碼酶的功能基因,由此確定該菌株的多碳利用性及共化機理。2017年,XU等[41]利用基因組結合轉錄組技術研究醬香型白酒釀造酵母ZygosaccharomycesbailiiMT15的發(fā)酵特性及其對特征風味的貢獻,比較發(fā)現其產特征風味的功能基因及其表達水平,以此確定MT15菌株的風味貢獻基因及機制。多組學結合技術相比單組學可較全面研究白酒釀造中微生物基因、表達、調控、代謝物間的關系,以準確、快捷、可見的方式為白酒釀造過程中未知的微生物問題“解謎”。

6 總結與展望

基因組學技術的發(fā)展使得人們對微生物的研究達到了前所未有的深度,如前文所述,基因組學已形成一套固有的分析技術體系,對研究微生物及其風味代謝物具有重要意義,可實現對釀造過程微生物及其代謝等的多方面認識。隨著科學研究技術的發(fā)展,基因組學用于解析白酒釀造微生態(tài)已逐漸成為一大熱門,但仍存在研究主要集中于解析群落微生物結構及多樣性，未能充分解析基因組數據,同時對多組學技術的應用不全面等問題。今后可從以下幾個方面對白酒釀造微生物開展深入研究：(1)充分利用基因組數據,從微生物結構及多樣性的基因解析層面上升到對微生物的基因挖掘中；(2)基因組學與生物信息學密不可分,對于龐大的基因組數據來說,生物信息學是基因組研究中強有力的手段,數字化及功能化應協(xié)同跟上；(3)整體性利用多組學結合技術,提高對白酒釀造微生物的多層次認識。