QuEChERS-超濾凈化結(jié)合GC-QQQ測定釀酒大曲中多種農(nóng)藥殘留量

曹栩菡,黃小軍,葉麟,潘才惠

1(四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院,四川 瀘州,646000)2(四川國檢檢測有限責(zé)任公司,四川 瀘州,646000)

釀酒大曲可以為白酒的釀造提供營養(yǎng)物質(zhì)、香味成分,以及為微生物種群提供相關(guān)的生物酶,是濃香型和醬香型白酒重要的糖化發(fā)酵動力。常用的大曲原料有小麥、大麥和豌豆[1],原料經(jīng)粉碎、加水拌和,壓制成塊狀,天然接種,多菌種混合自然發(fā)酵而成[2]。在制曲時為防止有害菌的生長,制曲原料中有時會適當(dāng)添加中草藥。但無論是小麥、大麥、豌豆還是中草藥,在種植過程中為防治病蟲害幾乎都會使用到殺蟲劑、除草劑等農(nóng)藥,雖然在制作過程中原料和輔料經(jīng)過清洗可減少部分農(nóng)藥殘留,但仍會有農(nóng)藥殘留,而曲藥中的農(nóng)藥殘留可能會部分遷移至酒中,影響酒的質(zhì)量。目前,有關(guān)酒類產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測研究已有很多,檢測對象多為成品白酒[3]、葡萄酒[4-5]、黃酒[6]和啤酒[7]。雖然大型酒廠已將原料農(nóng)藥殘留作為一項嚴控指標,但目前對白酒曲藥中的農(nóng)藥殘留檢測分析尚少見報道。

農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有：氣相色譜法[7]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、高效液相色譜法[9]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、液相色譜-電噴霧質(zhì)譜法[10]、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[11]、氣/液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[4]等。在農(nóng)藥殘留檢測中,樣品前處理技術(shù)的選擇十分重要,常用處理方法為：固相萃取法[12]、固相微萃取法[13]、液-液萃取法[14]及QuEChERS法[15-16]等。QuEChERS法具有經(jīng)濟環(huán)保、操作簡便、適用范圍廣等優(yōu)點,但凈化效果要相比固相萃取色譜法差,尤其是多組分同時監(jiān)測時,雜質(zhì)凈化不徹底會造成離子干擾,影響定量準確性。

因此在利用QuEChERS法作為農(nóng)藥殘留樣品的前處理技術(shù)時,十分有必要結(jié)合一種更為有效的凈化方式。超濾是一種加壓膜分離技術(shù),膜孔徑介于微濾和反滲透之間,通過膜表面的微孔結(jié)構(gòu)對物質(zhì)進行選擇性分離,在食品飲料、化工電子和生物環(huán)境等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[17-18]。在一定壓力下,小分子物質(zhì)可穿過一定孔徑的特制薄膜,而大分子物質(zhì)不能透過,從而將兩者分開。農(nóng)藥的分子質(zhì)量一般小于500 Da,將超濾管應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測的前處理,截留物質(zhì)的分子質(zhì)量范圍為1×103～ 1×105Da[19],可以滿足農(nóng)藥與食品中蛋白質(zhì)及其他大分子雜質(zhì)分離的目的[20]。

本文采用QuEChERS法結(jié)合超濾凈化柱對樣品進行前處理,再結(jié)合氣相色譜法-三重四級桿質(zhì)譜法(ultrafiltration purification combined with-chromatography triple quadrupole mass spectrometry,GC-QQQ)測定釀酒大曲中23種有機磷農(nóng)藥殘留,以期快速、簡便、準確地掌握大曲中農(nóng)藥殘留情況,為提升白酒釀造品質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒大曲試樣,酒企提供；QuEChERS提取包、m-PFC超濾凈化柱 (復(fù)雜基質(zhì)),北京綠棉科技有限公司；丙酮、二氯甲烷、乙腈、乙酸乙酯 (均為色譜純),德國默克公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠 (primary-secondary amine,PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18),天津博納艾杰爾科技有限公司。

標準品(100 μg/mL)：敵敵畏、甲胺磷、乙酰甲胺磷、滅線磷、甲拌磷、氧樂果、特丁硫磷、氯唑磷、甲基毒死蜱、樂果、甲基嘧啶磷、毒死蜱、甲基對硫磷、倍硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、對硫磷、甲基異柳磷、水胺硫磷、殺撲磷、丙溴磷、硫環(huán)磷、三唑磷,環(huán)氧七氯B,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。所有溶液均采用超純水配制。

7890B—7000C氣-質(zhì)聯(lián)用儀(配備Agilent7696A自動進樣器),美國Agilent公司；MiLL-Q純水機,美國Millipore公司；T10高速均質(zhì)儀,德國IKA公司；TD5A-WS離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司；MPEva GS平行濃縮儀,睿萊博儀器(廣州)有限公司；XS204電子天平,梅特勒-托利多儀器 (上海) 有限公司；JL-721DTH數(shù)控超聲波清洗器,中國南京科捷分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取

振蕩法提取：稱取粉碎并過篩后的試樣 5 g (精確至0.1 mg) 于50 mL聚丙烯具塞離心管中,加10 mL超純水后渦旋混勻,靜置 30 min,加入10 mL乙腈提取溶劑、QuEChERS提取包 (含6 g無水MgSO4、1.5 g醋酸鈉) 及1顆陶瓷均質(zhì)子,蓋上離心管蓋,劇烈振蕩1 min,4 200 r/min 離心5 min,取上清液待凈化[21]。

超聲波法提?。悍Q取粉碎并過篩后的試樣 5 g (精確至0.1 mg) 于50 mL聚丙烯具塞離心管中,加10 mL超純水后渦旋混勻,靜置 30 min,加入10 mL乙腈提取溶劑,蓋上離心管蓋,超聲萃取20 min,4 200 r/min離心 5 min,取上清液待凈化。

均質(zhì)法提取：稱取粉碎并過篩后的試樣 5 g (精確至0.1 mg) 于50 mL聚丙烯具塞離心管中,加10 mL超純水后渦旋混勻,靜置30 min,加入10 mL乙腈提取溶劑,均質(zhì)提取1 min,4 200 r/min離心5 min,取上清液待凈化。

1.2.1.2 凈化

國家標準QuEChERS凈化法：移取6 mL上清液加到含1 200 mg MgSO4、400 mg PSA及400 mg C18的15 mL塑料離心管中,漩渦混勻1 min,4 200 r/min離心5 min,準確吸取2 mL上清液,待用[21]。

超濾凈化柱法：移取1 mL上清液,從超濾凈化柱頂部加入,緩慢推動柱塞桿,使上清液緩慢通過凈化材料,即凈化完成,待用。

1.2.2 空白實驗

除不加試樣外,按照1.2.1小節(jié)中方法進行空白試驗。

1.2.3 標準儲備液與工作液的配制

混合標準溶液：吸取一定量的農(nóng)藥標準品于10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度。混合標準溶液質(zhì)量濃度為5、10、50、100、500、1000 μg/L。

內(nèi)標溶液：將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的環(huán)氧七氯B標準溶液,用乙酸乙酯稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg/L的內(nèi)標溶液。

基質(zhì)混合標準工作液：空白基質(zhì)溶液按1.2.1小節(jié)中方法處理后于40 ℃水浴中氮氣吹至近干,分別加入1 mL相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標準溶液,復(fù)溶,過濾(0.22 μm有機濾頭),上機測定。基質(zhì)混合標準工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.4.1 氣相色譜條件

色譜柱為安捷倫VF1701 (30 m×250 μm,0.25 μm)；程序升溫：初始溫度為40 ℃,保持1 min,以40 ℃/min升至120 ℃,再以5 ℃/min,升至240 ℃,再以12 ℃/min,升至300 ℃保留6 min；載氣：氦氣,純度≥99.99%,流速1.0 mL/min；進樣方式：2層夾層進樣,氣隙0.2 μL,樣品進樣1 μL,內(nèi)標進樣1 μL,脈沖不分流,0.75 min后打開隔墊吹掃閥。

1.2.4.2 質(zhì)譜條件

EI源,電子能量70 eV；離子源溫度 280 ℃,傳輸線溫度 280 ℃；碰撞氣為氮氣,純度≥99.999%；溶劑延遲 3 min；數(shù)據(jù)采集模式,MRM。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 MassHunter(B.06.00.SP01)軟件進行數(shù)據(jù)采集及處理,Excel 2016 計算測試數(shù)據(jù)回收率和相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

提取溶劑是影響目標物提取效率及基質(zhì)效應(yīng)的重要因素。分別采用丙酮、二氯甲烷、乙腈作為釀酒大曲中23種農(nóng)藥殘留的提取溶劑,按1.2.1小節(jié)的樣品預(yù)處理方法,分別加入10 mL丙酮、二氯甲烷、乙腈,考察不同溶劑對23種目標農(nóng)藥的提取效率。結(jié)果表明,丙酮、二氯甲烷、乙腈溶劑均可以將樣品中的農(nóng)藥提取出來,其中以乙腈對絕大多數(shù)目標物的提取效果較好(85%～100%),可能是因為乙腈極性較強且分子較小,受基質(zhì)的干擾最小(圖1-a)。因此選擇乙腈為目標物提取溶劑。

2.1.2 提取方式的選擇

為了提高有機溶劑對目標農(nóng)藥的提取效率,選用常用的振蕩法、超聲波法、均質(zhì)法3種提取方式(按1.2.1小節(jié)進行樣品前處理)。如圖1-b 所示,均質(zhì)法的回收率(82%～102%)高于振蕩法和超聲波法。但由于均質(zhì)的剪切力過強[22],易將大曲試樣中的色素等物質(zhì)一同萃取出來,給后續(xù)凈化工作增加困難。超聲波提取與振蕩提取回收率接近,但超聲波提取需要時間較長且提取過程不易控制,振蕩法操作簡單。因此選擇劇烈振蕩的提取方式。

a-提取劑對回收率的影響；b-提取方式對回收率的影響；c-凈化方式對回收率的影響圖1 不同條件對提取效率的影響Fig.1 Recoveries of 23 pesticides in Daqu with different conditions注:各編號對應(yīng)農(nóng)藥見表1

表1 MRM模式下各種農(nóng)藥保留時間、特征離子對、碰撞能量及優(yōu)化條件下測得的23種農(nóng)藥的線性方程、回歸系數(shù)(n=3)Table 1 In MRM mode, the various pesticides’ retention time, characteristic ion pair, and collision energy; Linear equations and regression coefficients of 23 pesticides obtained under optimized conditions

2.1.3 凈化條件的比較

分別采用國家標準法和超濾凈化柱凈化2種凈化方式對試樣進行凈化處理,考察不同凈化方法對釀酒大曲中23種目標物提取效率的影響。如圖1-c所示,國家標準法(80%～92%)和超濾凈化柱法(84%～103%)均有較好的回收效率,但超濾凈化柱法極大地簡化了實驗流程,批處理樣品更為簡便快捷。

2.2 特征離子的選擇

根據(jù)豐度和質(zhì)荷比優(yōu)化MRM條件,優(yōu)化后的特征離子及碰撞能量見表1,MRM總離子流圖見圖2。

圖2 大曲基質(zhì)中23種有機磷農(nóng)藥殘留混標氣相色譜譜圖Fig.2 Mixed standard gas chromatogram of 23 kinds of organophosphorus pesticide residues in Daqu

2.3 方法性能指標考察

2.3.1 線性關(guān)系

在優(yōu)化實驗條件下,以1.2.2小節(jié)的方法配制混合標準工作溶液,上機測定。以目標物與內(nèi)標物的相對質(zhì)量濃度為橫坐標,以目標物與內(nèi)標物的相對峰面積比為縱坐標,進行線性回歸,得到各目標物線性關(guān)系,以R2≥0.99為判斷指標,確定各目標物的線性范圍,具體參數(shù)見表1。由表1可知所有目標物的R2均達到0.999以上,表明23種農(nóng)藥均具有很好的線性關(guān)系,能夠很好的滿足分析要求。

2.3.2 回收率、檢出限與定量限

目前國家未對釀酒曲藥農(nóng)藥殘留制定限量標準,但曲藥大多以谷物為主要原料,本實驗參照GB/T 27404—2008[23],結(jié)合GB 2763—2019中谷物類農(nóng)藥殘留限量[24],選取3個質(zhì)量濃度水平(0.05、0.1、0.2 mg/kg),以釀酒大曲為基質(zhì)做加標回收試驗,每個質(zhì)量濃度做6次平行,計算平均回收率和相對標準偏差(RSD)。由表2可知,結(jié)果表明23種目標物的回收率在85%～106%,相對標準偏差均小于10%。以0.05 mg/kg添加水平為依據(jù),采用特征離子質(zhì)量色譜圖信噪比S/N≥3計算檢出限和以S/N≥10計算定量限。結(jié)果顯示檢測限和定量限分別在0.002～0.035 mg/kg和0.007～0.118 mg/kg,滿足GB 2763—2019中對谷物類農(nóng)藥殘留檢測的要求。

表2 23種農(nóng)藥平均回收率、檢出限和定量限(n=6)Table 3 Average recouery rate, the limits of detection and limits of quantitation of the 23 pesticides

2.4 實際樣品檢測

利用優(yōu)化后的實驗方法檢測了10組釀酒大曲,大部分曲藥未檢出農(nóng)藥殘留,只有1組樣品中檢出毒死蜱(0.013 mg/kg)和馬拉硫磷(0.020 mg/kg),檢測結(jié)果見表3。

表3 實樣測試結(jié)果Table 3 Test results of actual samples

3 結(jié)論與討論

采用GC-QQQ法對釀酒大曲中可能存在的23種有機磷農(nóng)藥進行同時檢測，對樣品前處理方法進行了優(yōu)化，以乙腈為提取劑獲得了較好的回收率；提取方式上，振蕩法操作簡單、快速，對23種目標農(nóng)藥的回收率與超聲波法接近，在試樣提取過程控制上優(yōu)于均質(zhì)法和超聲波法；考查了國家標準法、超濾凈化柱2種凈化方式,國家標準[21]中采用的凈化方式是試樣經(jīng)提取、離心后取上清液加入無水硫酸鎂、PSA和C18。其中無水硫酸鎂為干燥劑,主要目的是去除提取液中的水,以保證其他凈化物的吸附效果。PSA和C18作為凈化物,由于PSA中含2個氨基,提供了更大的離子交換容量,能通過氫鍵萃取極性化合物,經(jīng)PSA凈化后的樣品極性化合物保留度較高,且能有效去除樣品基質(zhì)中的有機酸、色素和糖類雜質(zhì)；C18的有效成分是硅膠鍵合的十八烷基,具有疏水性,主要是去除脂肪和非極性物質(zhì)。2種凈化方式對目標農(nóng)藥的回收效率接近,但超濾凈化柱法批處理樣品更為簡便快捷。

在前處理優(yōu)化方案的基礎(chǔ)上,建立了QuEChERS-GC-QQQ對釀酒大曲中可能存在的23種有機磷農(nóng)藥進行同時檢測的方法。方法前處理簡單、快速,23種有機磷農(nóng)藥的檢出限、定量限和回收率均能滿足農(nóng)藥殘留分析檢測技術(shù)[21]要求,可用于釀酒大曲中多種農(nóng)藥殘留檢測分析。