超聲波對(duì)不同鹽濃度下肌原纖維蛋白溶解性的影響

趙穎穎,李三影,田金鳳,扶磊,賈豐鮮,李可*,吳麗麗,白艷紅

1(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州,450001)2(河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州,450001)

雞胸肉,脂肪含量低,蛋白質(zhì)含量高,與植物蛋白相比,雞肉蛋白具有較高的消化率(0.92)[1-2]。雞胸肉肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)是肌肉中主要的蛋白質(zhì),約占總蛋白含量的50%～60%[3],由于在高鹽溶液(0.48～0.67 mol/L NaCl)中易溶解,又被稱為鹽溶性蛋白[4]。過(guò)量攝入鈉會(huì)增加患高血壓和心血管等疾病風(fēng)險(xiǎn)。因此,如何降低加工肉制品中的鈉鹽含量對(duì)于人體健康尤為重要。

高強(qiáng)度超聲波作為一種綠色的食品物理加工技術(shù),被認(rèn)為是安全、無(wú)毒、環(huán)保的。低頻高強(qiáng)度超聲波(頻率16 k～100 kHz,超聲強(qiáng)度在10～100 W/cm2)可用于改變食品的物理或化學(xué)性質(zhì),廣泛應(yīng)用于食品加工[5-6]。MARIANA等[7]報(bào)道了超聲波處理可以彌補(bǔ)肉糜中磷酸鹽含量降低帶來(lái)的缺陷。CHO和ITO等[8-10]研究報(bào)道了應(yīng)用低頻(20 kHz)超聲波破壞肌原纖維結(jié)構(gòu)是必不可少的前處理方法。超聲波處理能有效促進(jìn)脊椎動(dòng)物肌肉MP溶解,能使80%以上的MP在極低離子強(qiáng)度溶液中溶解。WANG等[11]研究了超聲波對(duì)高鹽濃度下雞肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和溶解度的影響,并觀察到超聲波處理對(duì)雞肉肌原纖維蛋白的表面疏水性,活性巰基和溶解度顯著增加。LIU等[12]探討了不同超聲波功率對(duì)MP在水中的溶解度和分散性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),超聲波處理破壞和抑制肌絲組裝,增加了在MP水中的溶解性。

肉品加工中至少添加一定量鹽，探討超聲波處理時(shí)間和鹽濃度對(duì)MP理化性質(zhì)的影響十分有必要。本試驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)不同NaCl濃度下雞胸肉MP進(jìn)行不同時(shí)間的超聲波處理,測(cè)定MP的溶解度、濁度、粒徑、電位以及二級(jí)結(jié)構(gòu),分析超聲波時(shí)間對(duì)3種鹽濃度下MP溶解性的影響,為超聲波技術(shù)在低鹽肉品加工中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白羽雞雞胸肉,鄭州丹尼斯超市。剔除雞胸肉中結(jié)締組織及多余脂肪,用真空袋分裝,每袋200 g,儲(chǔ)存于-20 ℃,貯藏時(shí)間不超過(guò)2周。

NaCl、MgCl2、NaH2PO3、Na2HPO3等均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA),北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；十二烷基硫酸鈉,上海源葉生物有限公司；牛血清白蛋白(純度為98%),Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SZ-22A絞肉機(jī),廣州旭眾食品機(jī)械有限公司；XHF-D高速分散器(內(nèi)切式勻漿機(jī)),寧波新芝生物科技股份有限公司；AvantiJ-26S XPI大容量高速冷凍離心機(jī),美國(guó)Beckman Coulter 公司；VCX-750超聲波細(xì)胞破碎儀,美國(guó)Sonic公司；TGL-20KR高速冷凍離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司；Nano-ZS90納米激光粒度儀,英國(guó)馬爾文儀器公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀,德國(guó)Bruker公司；PHSJ-3F pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;Lab-1-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MP的提取

參考ZHAO等[13]的方法提取。將雞胸肉提前12 h在4 ℃冰箱解凍,切成l～2 cm見(jiàn)方的小塊,3 000 r/min絞碎15 s,重復(fù)4次。在0～4 ℃條件下提取MP。均勻絞碎的雞胸肉∶分離緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4,0.1 mol/L NaCl,20 mmol/L MgCl2,10 mmol/L EDTA,pH 7.0)=1∶4 (g∶mL)比例均勻混合,6 000 r/min轉(zhuǎn)速下均質(zhì)3次,每次30 s；混合物用20目篩網(wǎng)(孔徑0.9 mm)過(guò)濾后,2 000×g離心15 min,收集沉淀物質(zhì),重復(fù)2次,得到MP沉淀。將沉淀物按1∶4 (g∶mL)的比例均勻分散在0.1 mol/L NaCl溶液中,2 000 ×g離心15 min,重復(fù)2次,得到純化的MP。

1.3.2 低頻高強(qiáng)度超聲波處理

將上述提取的MP分別用含0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4,pH 7.0)稀釋至質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MP溶液,取70 mL溶液于100 mL燒杯中進(jìn)行超聲波處理。13 mm的超聲波探頭放入MP溶液液面下25 mm處,超聲波參數(shù)為：頻率20 kHz,功率450 W,工作模式：超聲2 s,休息4 s,超聲波時(shí)間分別設(shè)定為0、3、6和9 min。利用冰水浴控制所有樣品最終溫度低于12 ℃。參考JAMBRAK等[14]的方法測(cè)定,超聲波強(qiáng)度為(30.26±2.73) W/cm2。

1.3.3 溶解度的測(cè)定

MP的溶解度參考ZHANG等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。取10 mL離心管,加入5 mL處理后的MP,然后在4 ℃下以10 000 ×g離心20 min,用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)的溶解度以離心后的上清液中的蛋白濃度表示。

1.3.4 濁度的測(cè)定

參考LI等[16]的方法，用相應(yīng)鹽濃度的磷酸鹽緩沖液將超聲波處理后的各組MP樣品稀釋至1 mg/mL,在660 nm 處測(cè)定吸光度。參比溶液為相應(yīng)鹽濃度的磷酸鹽緩沖液,平行測(cè)3次并取平均值。

1.3.5 Zeta電位的測(cè)定

參考張興等[17]的測(cè)定方法,取1 mL樣品于Zeta電位皿內(nèi),同時(shí)蓋兩邊的蓋子,保持左右液面等高,用激光粒度儀測(cè)試MP的電位。

1.3.6 平均粒徑及粒徑分布的測(cè)定

用相應(yīng)鹽濃度的磷酸鹽緩沖液將超聲波處理后的MP樣品調(diào)整至質(zhì)量濃度0.5 mg/mL,使用激光粒度儀測(cè)定樣品的粒徑,通過(guò)自帶軟件自動(dòng)獲取粒徑,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.7 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

參考LI等[18]的方法,稍加修改。測(cè)定MP的傅里葉變化紅外光譜以獲取MP二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。MP懸浮液在凍干機(jī)中干燥24 h,將凍干MP粉與干燥的KBr 以1∶150的質(zhì)量比充分混合研磨,再用壓片機(jī)壓成1 mm厚的薄片。壓力為10 kPa,壓片時(shí)間1 min,然后在室溫下,用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)4 000～400 cm-1區(qū)域的所有光譜進(jìn)行64次掃描分析。利用Peak Fit軟件提取1 700～1 600 cm-1區(qū)域的譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)峰值擬合以獲得蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。

1.4 數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析

使用Origin 8作圖,使用SPSS 20.0軟件的方差分析(ANOVA)用于溶解度、濁度、Zeta電位、粒徑數(shù)據(jù)分析,對(duì)不同處理組進(jìn)行Duncan’s多重比較,P<0.05時(shí)認(rèn)為存在顯著差異。對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,當(dāng)P<0.05時(shí)判定2組(在同一鹽濃度下未超聲處理對(duì)照組與超聲9 min處理組)的平均值存在顯著差異。每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解度測(cè)定

如圖1所示,在不同鹽濃度下,隨著超聲時(shí)間的增加,MP溶解度顯著增大(P<0.05)。當(dāng)NaCl濃度為0.2 mol/L時(shí),隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng),MP溶解度從0.12 mg/mL增加到1.41 mg/mL(P<0.05)。由圖1可知,超聲波處理時(shí)間為9 min、0.2 mol/L NaCl濃度下MP溶解度比0.4 mol/L NaCl下未超聲的溶解度高。SALEEM等[19]研究雞肌動(dòng)球蛋白在0.1 mol/L NaCl中的溶解度也隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這些結(jié)果說(shuō)明,在不同NaCl濃度下,超聲波處理能夠?qū)崿F(xiàn)MP的增溶。在相同超聲時(shí)間下,0.6 mol/L NaCl濃度下的MP與其他離子濃度(0.2、0.4 mol/L)相比,溶解度顯著增大(P<0.05)。主要是因?yàn)镸P是鹽溶性蛋白,隨著鹽離子濃度(<0.8 mol/L)的增加,溶解度增大[20]。高強(qiáng)度超聲波處理能夠使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開,使更多的親水性氨基酸處在外層,從而提高蛋白質(zhì)的溶解性[21-22]。MP溶解度增加的原因可能是超聲空化作用產(chǎn)生的剪切力和沖擊力破壞了高度有序的絲狀肌球蛋白結(jié)構(gòu),降低了MP顆粒大小。由于MP顆粒尺寸的減小,MP顆粒比表面積的增加,可能會(huì)增加水-MP顆粒相互作用的能力,從而導(dǎo)致MP溶解性的增加[23]。

圖1 超聲波處理時(shí)間對(duì)不同鹽濃度下MP溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on MP solubility at different salt concentration注：字母不同表示不同樣品間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 濁度測(cè)定

超聲波處理時(shí)間對(duì)不同鹽濃度下MP濁度的影響見(jiàn)圖2。在相同NaCl濃度下,隨著超聲時(shí)間增加到3 min,不同離子濃度下的MP溶液的濁度顯著降低(P<0.05)。隨著超聲時(shí)間繼續(xù)增加,MP溶液的濁度值降低不顯著(P> 0.05)。結(jié)合圖2和表1可知,MP濁度與粒徑變化趨勢(shì)基本相同,這與SHANMMUGAM等[24]研究超聲波處理脫脂牛奶結(jié)果類似。由圖2可知,未經(jīng)超聲波處理的0.2 mol/L NaCl濃度下MP溶液A660值明顯高于0.6 mol/L NaCl濃度下MP溶液的A660值。

圖2 超聲波處理時(shí)間對(duì)不同鹽濃度下MP濁度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on MP turbidity at different salt concentration注：大寫字母不同表示同一超聲時(shí)間、不同鹽濃度組之間差異顯著 (P<0.05)；小寫字母不同表示同一鹽離子濃度組、不同超聲時(shí)間差異顯著 (P<0.05)(下同)

表1 超聲波處理時(shí)間對(duì)不同鹽濃度下MP平均粒徑的影響Table 1 Effect of different time of ultrasonic treatment on the average particle size of MP at different salt levels

TANG等[25]研究超聲波處理低鹽濃度下羅非魚肌動(dòng)球蛋白,其濁度的變化與本研究結(jié)果相同。不同離子濃度下的MP經(jīng)過(guò)超聲波處理后,與未超聲波處理組相比,濁度顯著降低(P<0.05),表明高強(qiáng)度超聲波能夠通過(guò)“空化效應(yīng)”破壞氫鍵和疏水相互作用,導(dǎo)致大的蛋白質(zhì)聚集體破碎成小的蛋白質(zhì)聚集體[26]。這些結(jié)果與MP溶解度增加相對(duì)應(yīng)。

2.3 Zeta電位

如圖3所示,在相同超聲波處理時(shí)間下,較高的鹽濃度(0.6 mol/L NaCl)Zeta電位的絕對(duì)值較低。這可能是由于介質(zhì)的離子強(qiáng)度增加,導(dǎo)致雙電層厚度減小[27]。WU等[28]報(bào)道在pH為7.5時(shí),當(dāng)NaCl濃度從0增加到0.8 mol/L時(shí),豬肉MP的電位絕對(duì)值降低。隨著超聲波處理時(shí)間的增加,0.2 mol/L NaCl下MP的電位絕對(duì)值增加不顯著(P> 0.05),而0.4 mol/L NaCl下MP的電位絕對(duì)值顯著增加(P<0.05),電位值提升了44%,這可能是超聲波處理導(dǎo)致MP的展開,更多帶負(fù)電的氨基酸暴露到MP的表面,使蛋白質(zhì)間的靜電斥力增強(qiáng),很難發(fā)生聚集,從而增加了MP溶液體系的穩(wěn)定性。

圖3 超聲波處理時(shí)間對(duì)不同鹽濃度下MP電位的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment time on MP potential at different salt concentration

2.4 平均粒徑及粒徑分布

蛋白質(zhì)的粒徑是影響蛋白質(zhì)功能特性的因素之一,也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的宏觀表現(xiàn)[29]。由表1可知,超聲波處理后0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl濃度下MP的平均粒徑分別從3 819、1 656、513.67 nm降低到1 656、438.50、253.10 nm(P<0.05),而隨著超聲時(shí)間的增加,MP的平均粒徑降低不顯著(P>0.05)。粒徑剛開始顯著降低可能是由于超聲提供的機(jī)械力使得MP之間的非共價(jià)鍵作用被打斷。隨著超聲時(shí)間的增加,平均粒徑變化相對(duì)緩慢,可能是因?yàn)橐呀?jīng)打開的MP分子間的相互作用相對(duì)變?nèi)鮗30]。李雨楓等[31]研究發(fā)現(xiàn)水洗提取的MP經(jīng)過(guò)超聲波處理后,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞,表現(xiàn)為較小粒徑的分散顆粒。

由圖4所示,超聲波處理不僅減小了MP的粒徑,而且提高了粒徑分布的均勻性。所有樣品組均表現(xiàn)出2個(gè)峰。隨著超聲波處理時(shí)間的增加,粒徑分布圖出現(xiàn)的2個(gè)峰值向小的粒徑范圍移動(dòng),且峰值范圍變窄。表明超聲波處理能夠使MP溶液的粒徑降低,并縮小粒徑的分布范圍使其更集中,更均勻。

圖4 超聲波處理時(shí)間對(duì)不同鹽濃度下MP粒徑分布的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on MP particle size distribution at different salt concentrations

LIU等[32]研究表明超聲波處理0.5 mol/L NaCl濃度的鰱魚肌球蛋白,不僅減小了肌球蛋白聚集體的粒徑,而且提高了均勻度,與本研究結(jié)果一致。

2.5 MP二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 超聲波處理時(shí)間對(duì)不同鹽濃度下MP的FTIR光譜圖Fig.5 FTIR spectrum of ultrasonic treatment time for MP at different salt concentrations

圖6顯示了超聲波處理不同鹽離子濃度下MP的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化。與未超聲樣品相比,超聲波處理9 min的樣品有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)減少,不同離子濃度下α-螺旋的含量分別降低了40%、33%和29%,β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲的含量皆增加。ZHANG等[36]研究表明,α-螺旋結(jié)構(gòu)通過(guò)肽鏈內(nèi)部的氫鍵穩(wěn)定,β-折疊結(jié)構(gòu)由肽鏈間的氫鍵穩(wěn)定。因此,α-螺旋含量降低表明,超聲處理使得部分分子內(nèi)氫鍵斷裂,使蛋白有序結(jié)構(gòu)被破壞,從而改變二級(jí)結(jié)構(gòu),使α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲,從而增加了MP的開放性和靈活性。張坤等[35]研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理使α-螺旋降低、β-折疊增加,可能是因?yàn)槌暡ǖ摹翱栈?yīng)”使α-螺旋肽鏈伸展變?yōu)榫€性的β-折疊,從而引起肌球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,使得肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白結(jié)合作用發(fā)生變化,進(jìn)而使肌動(dòng)球蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化。

圖6 MP二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)百分含量變化Fig.6 Relative content change of secondary structure in MP注：0.2-0和0.2-9表示：0.2 mol/L NaCl條件下超聲處理時(shí)間0 min 和 9 min;0.4-0和0.4-9表示：0.4 mol/L NaCl條件下超聲處理時(shí)間0 min 和 9 min;0.6-0和0.6-9表示：0.6 mol/L NaCl條件下超聲處理時(shí)間0 min 和 9 min

3 結(jié)論

低頻高強(qiáng)度超聲波(20 kHz,450 W,30 W/cm2)處理能夠有效改良不同鹽濃度下MP的理化性質(zhì)與溶解性。與未超聲樣品相比,超聲波處理后MP溶液溶解度顯著上升(P<0.05)、濁度顯著下降(P<0.05)、粒徑顯著變小(P<0.05)、電位絕對(duì)值顯著增大(P<0.05)、二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)由有序結(jié)構(gòu)(螺旋)向無(wú)序結(jié)構(gòu)(折疊等)轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。這些結(jié)果表明超聲波處理促進(jìn)了MP鏈展開,結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使降鹽水平下MP溶液更加穩(wěn)定,擁有更好的理化及溶解特性,可以在一定程度上彌補(bǔ)低鹽給肉制品帶來(lái)的缺陷。因此,該結(jié)果為超聲波技術(shù)在低鹽肉制品中的應(yīng)用提供一定理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。